顶空气相色谱法测定双氢青蒿素磷酸哌喹片中乙醇残留

贵晓霞，钱佳旦，王小平

浙江华立南湖制药有限公司，浙江嘉兴 314000

双氢青蒿素哌喹片是双氢青蒿素和磷酸哌喹组成的复方制剂。双氢青蒿素为青蒿素的衍生物，是青蒿素在体内的活性物质，对疟原虫无性体有较强的杀灭作用，能迅速杀灭疟原虫，从而控制疟疾。磷酸哌喹为4-氨基喹啉类抗疟药，抗疟作用与氯喹类似，影响疟原虫红内期裂殖体的超微结构，能使滋养体食物泡膜和线粒体肿胀，导致其生理功能破坏，从而杀死疟原虫，体内药效学研究提示二者合用具有增效作用，无增毒作用，可延缓疟原虫抗药性的产生。因该药在制剂生产过程中使用了乙醇进行制粒，乙醇为三类有机溶剂，根据《中国药典》2010年版附录溶剂残留要求及国际协调会议（ICH）相关指导原则的要求，乙醇残留限度为0.5%，需对双氢青蒿素哌喹片进行残留乙醇的测定。目前国内外尚未有测定双氢青蒿素哌喹片中乙醇残留的方法报道。笔者根据《中国药典》2010年版二部附录残留溶剂测定法和ICH的要求，建立了毛细管气相色谱法测定双氢青蒿素磷酸哌喹片中残留乙醇的方法，现报道如下：

1 仪器与试药

仪器：Agilent 7980气相色谱仪，HP7694顶空进样器，氢离子火焰（FID）检测器，赛多利斯BT125D电子天平。

样品：双氢青蒿素磷酸哌喹片（浙江华立南湖制药有限公司，批号：100923、080710、140710、100813、110710、210610）。试剂：纯化水、正丙醇、无水乙醇均为色谱级。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：DB-624（6%腈丙基苯基-94%二甲基硅氧烷，30 m×0.53 μm×3.0 μm）；氮气为载气；柱温：恒温 80 °C，保持10 min；流速：3.0 ml/min；分流比：10∶1；进样口温度：220℃；检测器温度：220℃；进样量：0.1 μl；顶空瓶平衡温度：80℃，保持30 min；定量环温度110℃；传输管温度：120℃；顶空瓶充压时间：0.5 min；压力：20 psi（1 psi=6.895 kPa）；定量环平衡时间：0.15 min；定量环取样时间：0.15 min；进样时间：1.0 min。采用顶空自动进样方式。

2.2 样品的制备

内标液的选择及制备：正丙醇与乙醇为同系物，故选择正丙醇为内标，取0.02 ml正丙醇于100 ml容量瓶中，精密称定，并用纯化水稀释至刻度，摇匀作为内标液。

对照品贮备液的制备：取乙醇0.7 ml（约0.5 g）于100 ml容量瓶，精密称定，并用纯化水稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。

对照品溶液的制备：制备对照品溶液中乙醇含量与样品中乙醇含量相当，取对照品贮备液1.0 ml置25 ml容量瓶中，纯化水稀释至刻度，取100.0 μl与内标液2.0 ml置于顶空瓶中，摇匀，加盖密封，作为对照品溶液。

样品的制备：双氢青蒿素磷酸哌喹片碾细，称取粉末约200 mg置于顶空瓶中，精密称定，加入内标液2.0 ml，摇匀，加盖密封，作为样品溶液。

空白溶剂的制备：取2.0 ml纯化水置顶空瓶中，加盖密封。

2.3 专一性选择试验

空白溶剂应对测定无干扰，乙醇峰与正丙醇峰分离度应大于2.0。理论塔板数按正丙醇峰计，不低于10000。空白溶剂、对照品贮备液、内标液、对照品溶液及样品色谱图分别见图 1～5。

结果显示，对照品中乙醇峰保留时间为3.356 min，正丙醇峰保留时间为4.505 min；正丙醇峰理论塔板数为43520，乙醇峰理论塔板数为63391；分离度为16.22。样品溶液重复进样6次，乙醇峰相对保留时间RSD为0.079%，正丙醇峰相对保留时间RSD为0.069%。样品中乙醇峰保留时间为3.358 min，正丙醇峰保留时间为4.506 min；正丙醇峰理论塔板数为43549，乙醇峰理论塔板数为63439；分离度为16.40。样品溶液重复进样6次，乙醇峰相对保留时间RSD为0.079%，正丙醇峰相对保留时间RSD为0.069%。

2.4 检测限与定量限试验

定量限：测试样品中乙醇含量能被定量测定的最低值。测试方法为用纯化水稀释对照品溶液，使信噪比达到约10∶1。

检测限：测试样品中乙醇含量能被检测到的最低值。用纯化水稀释对照品溶液，使信噪比达到约3∶1。定量限样品重复进样6次，计算RSD。要求RSD小于25%。结果显示，检测限=0.19 μg（S/N=3.27）；定量限=0.57 μg（S/N=10.54）。 定量限重复进样6次，RSD为17%。

2.5 线性关系考察

制备一系列浓度对照品溶液（相当于样品中乙醇含量在25%～500%），测定该范围内线性关系，要求r大于0.9900，回归线截距相对于100%样品中乙醇含量小于15%。测试方法为将对照品贮备液稀释10倍（稀释后约含乙醇0.5 mg/ml），取已稀释好的对照品贮备液 200.0、100.0、40.0、20.0、10.0 μl到顶空瓶中，分别加入内标液2.0 ml，加盖密封。制成系列浓度的对照品溶液测定。以乙醇含量为横坐标，乙醇峰面积与正丙醇峰面积之比为纵坐标，作图。结果显示，乙醇含量在5.49～109.80 μg范围内，线性关系良好。回归方程为Y=0.002X+0.003，r=0.9999。截距相对于100%样品中乙醇含量为6.39%。

2.6 准确度试验

图1 空白溶剂色谱图

图2 对照品贮备液色谱图

图3 内标液色谱图

图4 对照品溶液色谱图

图5 样品色谱图

采用加样回收的方法测定。要求回收率在90%～110%范围内，RSD小于5%。用已测得溶剂残留量的双氢青蒿素磷酸哌喹片作为乙醇加样回收的试样，称取双氢青蒿素磷酸哌喹片粉末约200 mg 9份，对照品贮备液稀释10倍（稀释后约含乙醇0.5 mg/ml），分别加入稀释过的对照品贮备液100.0、40.0、20.0 μl（加入的乙醇量相当于样品中含有乙醇量的250%、100%、50%），每个浓度配制3份样品。每份样品进样2次。结果：250%、100%、50%三个水平的回收率依次为94.87%、95.84%、96.19%，平均回收率为95.63%，RSD=3.32%。

2.7 精密度试验

重复性测试方法：对照品溶液重复进样9次。以乙醇峰面积与正丙醇峰面积之比计算RSD。要求RSD小于5%。结果显示，9次测试的RSD为1.73%。

分析重现性测试方法：精密称取双氢青蒿素磷酸哌喹片粉末160、200、240 mg各3份到顶空瓶中，分别加入2.0 ml内标，制成3个浓度9份样品。以乙醇峰面积与正丙醇峰面积之比计算RSD。要求RSD小于5%。结果显示，9次测试的RSD为3.26%。

2.8 稳定性试验

测定方法为对照品溶液，样品第一天测定后室温（约25℃）放置24 h重复测定。对照品溶液和样品各测试3份，每份分别测试2次，以其测试结果的平均值进行评价。结果显示，对照品放置一天后，乙醇的含量平均下降为98.43%，样品平均下降为98.74%。对照品溶液和样品溶液24 h内基本稳定。

2.9 样品中乙醇含量测定

测试6个批号的双氢青蒿素磷酸哌喹片中乙醇残留量，每个样品称取2份，每份约200 mg置顶空瓶中，分别加入内标液2.0 ml，摇匀，加盖密封，作为样品。每份样品进样测试 2次。 结果显示， 批号 080710、140710、100813、110710、210610、100923依次测得乙醇残留为0.01066%、0.01185%、0.01211%、0.00919%、0.00832%、0.01077%。6个批号乙醇残留量平均值为0.01050%。符合《中国药典》2010年版附录溶剂残留要求及ICH指导原则的要求（乙醇残留限度为0.5%）。

3 讨论

本文建立了一种采用顶空气相色谱法测定双氢青蒿素磷酸哌片中残留乙醇的方法。该方法简单、快捷、灵敏度高、精确。笔者对样品的配制浓度、对照品的配制浓度、内标液的选择、内标液浓度的配制、色谱柱类型的选择、柱温、顶空瓶平衡温度、顶空瓶平衡时间、载气流速、分流比、检测器温度、进样口温度都进行了摸索，选择了最佳的分析方法，并对该分析方法进行了验证。实验证明，采用顶空自动进样测定双氢青蒿素磷酸哌喹中的乙醇残留灵敏度高，重现性好，定量准确，精密度高，易于操作。对于固体制剂残留溶剂的测定，值得注意的是，应该选择好顶空瓶加热温度和平衡时间。本研究中试验了顶空瓶平衡时间20 min，但测试结果不理想（多次试验回收率达不到要求），故最终选择了80℃、30 min的条件。固体制剂中的残留溶剂测定因存在固体粉末，对溶剂在顶空瓶中的平衡过程会有一定影响，故应该让固体基质在顶空瓶中充分达到气-液-固三相平衡后再进样，以防止固体粉末基质对试验的影响。

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