RXRα基因遗传变异与2型糖尿病易感性的关系

叶 青 赵 旭 周 玲 陆 莹 杜文聪 李 倩 叶新华 俞晓芳 马建华 成金罗 高燕勤

(南京医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，江苏 南京 210029)

遗传因素在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的发生发展中起着重要作用〔1〕，其遗传率估计为70% ～80%。脂肪组织分泌的脂联素被证实与T2DM关系密切〔2〕。人体脂联素水平除受到脂联素基因多态性本身的影响，还受到有关调控基因的影响。在脂联素编码基因ADIPOQ的启动子区，存在功能性过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)反应元件(PPRE)。PPAR-γ与视黄醛X受体α(RXRα)形成的异二聚体直接与PPRE 结合，激活脂联素基因的转录〔3～6〕。因此，RXRα 是研究T2DM的候选基因之一。此前，本课题组已对PPAR-γ基因与T2DM遗传易感性进行研究〔7〕，但RXRα基因多态性与T2DM易感性的关系未见国内外报道。本研究拟探讨RXRα基因遗传变异与江苏汉族人群T2DM遗传易感性的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2008年3月至2010年8月，在江苏省南京、常州及仪征地区的南京医科大学三所附属医院，按照1999年WHO推荐的糖尿病诊断标准，即空腹血糖≥7.0 mmol/L或口服75 mg葡萄糖后2 h血糖(OGTT)≥11.1 mmol/L以及结合糖尿病病史，共收集门诊或住院的新诊断T2DM的患者1 105例为病例组，其中男性536例，女性569例，平均年龄(57.07±11.11)岁;同时期同地区在健康体检人群中收集正常对照(无内分泌代谢性疾病史，无血缘关系)1 107例，男性516例，女性591例，平均年龄(57.02±11.40)岁，两组年龄、性别频数匹配。病例组和对照组均来自汉族人群。

1.2 调查方法 使用统一设计的调查表，分别对患者和健康对照进行流行病学调查，主要询问内容包括一般人口学特征、T2DM等慢性病病史，测量身高、体重、血压、血糖等。上述调查和采样均获得被调查者同意并签署知情同意书。调查员为本校流行病与卫生统计学专业的研究生和内分泌专科医师，经统一培训合格后，方可参加面访调查。

1.3 方法

1.3.1 实验室检测 所有受试者均空腹过夜，抽取空腹静脉血和口服75 g葡萄糖2 h后的静脉血，用全自动生化仪测定血糖、TC(总胆固醇)、TG(甘油三酯)、HDL-C(高密度脂蛋白-胆固醇)、LDL-C(低密度脂蛋白-胆固醇)。病例组所有病人均做GAD(谷氨酸脱羧酶抗体)、ICA512(胰岛细胞抗体)(英国RSI公司试剂盒)检测，以排除1型糖尿病;用PCR/Apal酶切法做线粒体基因突变〔(Trnal EU(UUR)3243A＞G)〕检测，以排除线粒体基因突变型糖尿病。低温(－30℃)保存血清，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清脂联素指标。检测试剂盒购自RapidBio公司，酶标仪型号BIO-RAD Model680型。

1.3.2 基因位点的检测

1.3.2.1 RXRα基因位点的选择 采用选择潜在功能性单核苷酸(SNPs)位点的策略:以RXRα基因为研究的目的基因，从NCBI、HAPMAP等数据库以及已发表的文献中寻找和确认各基因的SNPs位点，选择在中国人群具有较高频率(MAF≥5%)并且可能影响基因功能的SNPs位点为研究靶点。确定了RXRα基因的4个 SNPs位点:rs1045570，rs4842194，rs3132291，rs4240711。探讨其与T2DM的易感性关系。

1.3.2.2 基因型检测 抽取研究对象外周血5 ml，采用酚-氯仿提取、乙醇沉淀的方法提取白细胞中的基因组DNA，并作为PCR模板。利用Real-time PCR联合 Taqman-MGB探针对RXRα基因的位点进行基因分型。按下列体系加样(5 μl体系):0.5 μl DNA 模板，2.5 μl TaqMan®Universal PCR Master Mix，0.25 μl顺式/反式引物，0.125 μl探针，1.25 μl ddH2O。反应条件:2 min 50℃、10 min 95℃，15 s 95℃，1 min 60℃，40 个循环。基因扩增的引物和探针序列见表1，利用SDS 2.0软件(ABI)观察结果。每块384孔板包括2个来自同一样本的阳性对照和2个空白样本的阴性对照。本研究中共检测2 212份DNA样本，成功率为100%，抽取其中10%样本重复检测，一致性100%。

表1 RXRα基因SNP位点基因扩增的引物和探针序列

1.4 统计学分析 采用EPIDATA3.1软件，两人双轨录入全部数据资料，核对无误后供分析使用。采用统计软件SPSS13.0进行数据的统计分析:χ2检验 、student-t检验用于分析人口学的基本特征、T2DM相关生物学指标及RXRα基因4个位点的等位基因频率在病例组和对照组的分布差异;Logistic回归分析计算OR值及95%CI;拟合优度χ2检验用于对照组基因型分布的Hardy-Weinberg平衡检验;采用LDA〔8〕软件(Linkage Disequilibrium Analyzer 1.0)分析基因连锁不平衡;运用PHASE 2.0软件根据观察到的基因型推断单倍型及其频率。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 在对照组中，对RXRα基因的 4 个 SNPs位点 (rs1045570，rs4842194，rs3132291，rs4240711)三种基因型的频率进行遗传平衡检验，结果显示实际频数与理论频数分布的差别均无统计学意义(P=0.458，0.471，0.389，0.703)，说明该对照组人群4个位点基因型频率分布均符合遗传平衡法则，具有人群代表性。

2.2 两组基本资料比较 病例组平均收缩压、舒张压、TG、TC、空腹血糖和脂联素水平显著高于对照组(P＜0.05);HDL-C显著低于对照组(P＜0.05)。两组的性别构成、平均年龄、体质指数(BMI)和LDL-C水平差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

2.3 单倍型分析 采用LDA软件，对上述4个位点SNPs的连锁不平衡分析显示，4个多态性位点处于低连锁不平衡(D'值0.1～0.8)。RXRα基因4个潜在功能性位点(顺序依次为rs1045570，rs3132291，rs4240711，rs4842194)构成的 4 种主要单倍型中，与最常见的单倍型GTAT相比，单倍型TTAT(含变异等位基因rs1045570T)可显著降低T2DM的患病风险〔调整OR(95%CI)=0.868(0.801～0.940)〕。见表3。

表2 两组基本资料比较(±s)

表2 两组基本资料比较(±s)

变量 病例组(n=1 105) 对照组(n=1 107) P值男/女(n)536/569 516/591 0.372年龄(岁) 57.07±11.11 57.02±11.40 0.380收缩压(mmHg) 137.99±20.56 127.93±18.13 ＜0.001舒张压(mmHg) 85.02±11.80 79.35±10.42 0.002 BMI(kg/m2) 24.88±3.55 24.15±3.27 0.069 HDL-C(mmol/L) 1.14±0.46 1.42±0.37 0.017 LDL-C(mmol/L) 2.82±0.96 2.57±0.89 0.062 TC(mmol/L) 5.16±1.37 5.04±0.95 ＜0.001 TG(mmol/L) 2.62±2.75 1.60±1.04 ＜0.001空腹血糖(mmol/L) 10.91±3.94 5.08±0.53 ＜0.001脂联素(mg/L)6.23±1.74 7.14±2.62 ＜0.001

表3 RXRα基因潜在功能性SNPs单倍型与T2DM易感性的关系

2.4 RXRα基因在病例组和对照组的基因型分布及其比较RXRα基因4个位点基因型和等位基因频率在两组间的分布无显著差异(均P＞0.05)。在调整性别、年龄和BMI等因素后，仍未发现4个位点与T2DM易感性存在统计学关联。见表4。

表4 RXRα基因多态性与T2DM易感性分析〔n(%)〕

3 讨论

RXRα是甲状腺/类固醇受体家族中的一种普通DNA结合受体。RXRα可被内源性激动剂9-顺式视磺酸激活，同样能激活 PPAR:RXR 复合物〔9〕。Metzger〔10〕等通过动物实验发现RXRα基因的表达在脂肪生成及肥大过程中起重要作用。此外，Wan〔11〕等研究发现缺乏肝脏RXRα的小鼠摄食量减少，增加体重以及改善糖耐受。Imai〔12〕和 Yang〔13〕都发现 RXRα 在肝细胞的增殖和生长过程中起重要作用。因此，有必要进行人群RXRα基因多态性与T2DM易感性的关联研究。本课题组采用病例对照研究，探讨中国南方汉族人群RXRα基因标签位点(另已报道)〔7〕和潜在功能性位点SNPs多态性与T2DM的关联性。本文4个潜在功能性位点等位基因频率与NCBI中中国人群的数据均相接近。经多因素回归分析调整年龄、性别及BMI后，4个位点均未发现与T2DM易感性存在统计学关联。

由RXRα基因的4个潜在功能性位点构成的单倍型分析中，发现单倍型TTAT(含变异等位基因 rs1045570T)较最常见的单倍型GTAT可显著降低T2DM的患病风险。推测变异等位基因rs1045570 T可能需要其他多态位点协同而发挥作用，存在位点-位点间的交互作用。本文样本人群中携带危险单倍型GTAT者达到50%以上，从这个角度而言，这些单倍型携带者是T2DM高危人群，更要避免和减少暴露肥胖等环境危险因素，应该强调通过科学的生活方式，包括合理膳食及坚持体育锻炼等，控制体重在正常水平，以预防和延缓T2DM的发生。值得指出的是本研究的阶段性资料(病例520例，对照550例)中，由于病例和对照组TTAT单倍型频率均很低，因此未显示该单倍型在两组的频率分布显著差异。同时，其他单倍型或有与本文相反结果。本文通过大样本的病例对照研究，一方面可以减少样本含量偏小可能造成的假阳性或假阴性错误，另一方面可以发现与T2DM易感性相关的突变频率相对较低的RXRα基因单核苷酸遗传变异位点，从而更客观地评价RXRα基因多态性在T2DM发生发展中的作用。

鉴于病例对照研究设计很难避免样本人群的偏倚问题，本文有关TTAT单倍型可降低T2DM发病风险的发现，有必要在其他人群中进一步验证，并进而通过功能实验得以确定。

1 O'Rahilly S，Barroso I，Wareham NJ.Genetic factors in type 2 diabetes:the end of the beginning〔J〕?Science，2005;307:370-3.

2 Gil-Campos M，Canete R，Gil A.Adiponectin，the missing link in insulin resistance and obesity〔J〕.Clin Nutr，2004;23:963-74.

3 Iwaki M，Matsuda M，Maeda N，et al.Induction of adiponectin，a fat-derived antidiabetic and antiatherogenic factor，by nuclear receptors〔J〕.Diabetes，2003;52:1655-63.

4 Neumeier M，Weigert J，Schaffler A，et al.Regulation of adiponectin re-ceptor 1 in human hepatocytes by agonists of nuclear receptors〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;334(3):924-9.

5 Yamamoto Y，Hirose H，Miyashita K，et al.PPAR(gamma)2 gene Pro12Ala polymorphism may influence serum level of an adipocyte-derived protein，adiponectin，in the Japanese population〔J〕.Metabolism，2002;51:1407-9.

6 Thamer C，Machicao F，Fritsche A，et al.No influence of the PPARgamma2 Pro12Ala genotype on serum adiponectin concentrations in healthy Europeans〔J〕.Metabolism，2003;52:798-9.

7 Juan Du，Hui Shi，Ying Lu，et al.Tagging single nucleotide polymorphisms in peroxisome proliferators activated receptor-γ (PPAR-γ)and retinoid X receptor-α (RXR-α)gene and type 2 diabetes risk:a case-control study of a Chinese Han population〔J〕.J Biom Res，2011;25(1):33-41.

8 Keyue D，Kaxin Z，Fuchu HE，et al.LDA-a java-based linkage disequilibrium analyzer〔J〕.Bioinformatics，2003;19:2147-8.

9 Ray DM，Spinelli SL，O'Brien JJ，et al.Platelets as a novel target for PPAR gamma ligands:implications for inflammation，diabetes，and cardiovascular disease〔J〕.BioDrugs，2006;20(4):231-41.

10 Metzger D，Imai T，Jiang M，et al.Functional role of RXRs and PPAR gamma in mature adipocytes〔J〕.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2005;73:51-8.

11 WanYJ，Han G，Cai Y，et al.Hepatocyte retinoid X receptor-alpha-deficient mice have reduced food intake，increased body weight，and improved glucose tolerance〔J〕.Endocrinology，2003;144(2):605-11.

12 Imai T，Jiang M，Kastner P，et al.Selective ablation of retinoid X receptor alpha in hepatocytes impairs their lifespan and regenerative capacity〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2001;98:4581-6.

13 Yang X，Guo ML，Yu-Jui Yvonne Wan.Deregulation of growth factor，circadian clock，and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers〔J〕.Am J Pathol，2010;176:733-43.