淀粉糊化过程的数字图像分析技术动态监测*

高群玉 谢钦

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)

淀粉是食品中最常见的碳水化合物，淀粉相变或糊化过程对于食品加工非常重要［1］.淀粉糊化的研究始于19世纪初，但至今这种水热处理导致的结构上的转变过程仍未被理解透彻［2］.目前比较常见的定义为:当淀粉在水中加热时，其多晶性逐渐消失，导致了结构上的破坏，这种由热导致的淀粉颗粒破坏或者由规则结构向不规则转变的相变过程称为糊化［3］.

淀粉颗粒在经历各种热加工过程和单元操作后，会处于部分甚至全部糊化的不同阶段，从而影响食品的功能和结构性质［4］.因此监测和控制淀粉的糊化程度具有重要意义.

原淀粉的结构以分子尺度、薄层尺度、生长圈尺度和整个淀粉颗粒尺度4种不同的尺度进行分层组合，这4种尺度层次都与糊化现象相关联［3］.淀粉的糊化及相关性质可以用许多基于化学、酶学和物理学的实验手段和技术测量得到，包括测量双十字消失点、差式扫描量热仪(DSC)/热机械分析仪检测热焓变化、核磁共振等［4］.这些方法的原理不同，它们从不同的角度表征淀粉的糊化特性，测量得到的物化性质有一定的差异，各自独特而又相互联系.

双折射被用来表征光波长度约为500 nm尺度下的颗粒的规则结构［3］.使用带有偏光的热台显微镜观察淀粉颗粒的糊化过程时，2%和98%的颗粒失去偏光时的温度分别被定义为糊化起始温度和糊化终止温度，后者也常被称为双折射结束点温度［5］.DSC的结果包括用以描述当加热淀粉－水混合物时吸热转换的谱图、与破坏淀粉结构所需能量有关的糊化焓值及反映淀粉有序结构被破坏的温度范围的糊化温度(糊化吸热的起始、峰值和终点糊化温度)，这些数据提供了与糊化机理、淀粉颗粒结构和性质等相关的诸多信息［6］.

数字图像分析技术被运用于医学、地质和食品质量控制等多个领域［7-9］，它们主要是通过采集有关数字照片后，使用专业图像分析软件对所关心的目标区域进行诸如数量、尺寸、颜色和光强度等方面的分析，得到相关数据.淀粉的膨胀糊化过程也可利用图像分析软件进行研究，如Parada等［10］分析了马铃薯淀粉保温糊化过程中的粒径累积分布、颗粒尺寸和长短径比，得到了马铃薯淀粉糊化剩余颗粒与血糖值响应的关系;Blennow等［11］针对玉米淀粉在含有蔗糖和水凝胶的水体系中的膨胀过程，建立了数学模型.

光密度(OD)分析被广泛运用于生物医学特别是分子生物学试验样品中，它能间接反应样品中阳性物质的相对含量，常被用来测量细胞染色后的阳性反应值.而样品上某一部位内的IOD值(定义为该部位所在区域内的所有像素点的OD值的总和)与该部位内所含的阳性物质的总量成正比［12-13］，因此，笔者将淀粉颗粒的晶体结构看作“阳性物质”，基于晶体结构的强弱与其在偏振光下的双折射光亮度成正比的特点，提出了累积光密度法，即利用图像处理软件Image-Pro Plus 5.0处理分析淀粉糊化过程的偏光图片，得到表示淀粉结晶结构强弱的偏光IOD值，然后用IOD值进行计算得到糊化度.此外，还将累积光密度法与偏光十字颗粒消失法、剩余偏光十字面积法和DSC焓变积分法进行了比较.

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

主要材料与仪器如下:马铃薯淀粉，嵩天集团有限公司生产;THMSE600型热台，LINRAM公司生产;装配有Micro Publisher 3.3 RTV型数码相机的偏光显微镜，Olympus公司生产;DSC8000型DSC，PerkinElmer公司生产.

1.2 试验方法

1.2.1 偏光图片的采集

淀粉乳(水分含量约为80%)适量，密封于两片圆形盖玻片之间，置于装配有数码相机的热台偏光显微镜下，先以5℃/s升温至40℃，然后以2℃/s升温，于不同温度点在线拍摄得到淀粉糊化过程的数码照片，实验记录的温度范围为40～80℃，40～60℃阶段每5℃、60～80℃阶段每2℃采集一张数码照片.此外，将一个视频监视器连接照相机输出颗粒双十字的在线图像.图像保存格式为TIFF，大小为2048×1536.

1.2.2 DSC 测量

称量一定量淀粉，加蒸馏水配成一定浓度(淀粉干基/水质量比为1∶4)的淀粉乳，密封在高压不锈钢DSC盘中，在室温下平衡2h后进行扫描.氮气通入速度为20mL/s，升温程序与热台实验相同.

1.2.3 4 种糊化度检测方法

累积光密度法(简称IOD法):利用Image-Pro Plus 5.0计算出每张数码图片的IOD值为初测IOD值，定义所有双折射光消失的图片的IOD值为背景IOD值，所以每张图片上淀粉颗粒的实际IOD值=初测IOD值－背景IOD值.IOD法测得的糊化度(DI)=(1－实际IOD值/40℃时的实际IOD值)×100%.

剩余偏光十字面积法(简称面积法):Parada等［10］认为淀粉偏光区域的多角形面积与糊化度有良好的相关性(r2=0.975).所以，用软件Image-Pro Plus 5.0自动识别出淀粉未糊化的多角形偏光区域，并计算它的面积.面积法测得的糊化度(DA)=(1－剩余偏光面积/初始总面积)×100%.

偏光十字颗粒消失法(后称数颗粒法):以偏光十字完全消失为标准，统计淀粉颗粒的数量.数颗粒法测得的糊化度(DC)=偏光十字消失的颗粒数/初始总颗粒数×100%.

DSC焓变积分法(简称DSC法):用DSC自带的Pyris软件，分析淀粉的糊化焓值谱图.某温度点的糊化度为从峰起始点到该温度的积分面积占整个糊化温度范围内积分面积的比例.DSC法测得的糊化度(DD)=为某特定温度点，T0为起始糊化温度，T为某一温度点.

文中初始状态是指40℃时的状态，所有数据为4次平行实验的平均值.

2 结果与分析

2.1 普通光及偏光图片

图1示出了升温过程中不同温度点马铃薯淀粉在普通光下的照片(左边图)及其对应的偏振光下的双折射光照片(右边图).在整个糊化过程中，淀粉颗粒经历了膨胀、偏光十字减弱直至消失的过程.在糊化过程中，颗粒有3种状态:全部糊化(偏光完全消失)、部分糊化(偏光面积减少，亮度减弱)及未糊化(偏光基本没有变化).在糊化中期，大部分淀粉都处于部分糊化这一中间状态.淀粉颗粒在较低温度下(50℃之前)便发生了细微的膨胀(用图像分析软件可以测量到)，特别是有破损的颗粒，膨胀更早更剧烈，同时伴随双折射光的明显减弱.这可能与水分对淀粉颗粒更好的浸润有关.由图1可知，一张图片可以观察到1000个以上淀粉颗粒，因此文中提出的方法可实现淀粉在显微镜下的较高密度观察，减少了实验工作量.

图1 马铃薯淀粉在升温过程中不同温度下的普通光照片和偏光照片Fig.1 Micrographs of potato starch at different temperatures during heating process respectively under normal light and polarized light

2.2 4种糊化度检测方法的比较

图2示出了用4种糊化度检测方法测得的马铃薯淀粉的温度－糊化度曲线.在同一温度下，4种方法测得的糊化度大小顺序是DI＞DA＞DC＞DD.这种差别与它们的测量原理有关.DI值是与面积和OD值都相关的函数，面积对应的是淀粉结晶结构数量的多少，OD则与淀粉结晶程度的强弱成正比.DA只是面积的函数，因此无法表征结晶程度减弱但未消失的部分，图2显示，DA在温度较低时 (55℃以下)出现负值，这是因为淀粉颗粒膨胀，使偏光面积增大，但仍未达到使偏光消失的程度.因此IOD法的准确性和灵敏度更高.传统的数颗粒法关注的只有淀粉颗粒的数量，而数量本身甚至不是一个几何参数［10］，所以该方法同样无法表征出处于部分糊化的淀粉的状态，其准确性和灵敏度在3种利用偏光显微镜测量淀粉糊化度的方法中都是最低的.

图2 4种检测方法的糊化度Fig.2 Gelatinization degrees detected by four methods

由图2可知，当马铃薯淀粉悬浮在过量水中并加热时，其整体结晶程度在较低温度下(50℃以下)便开始降低，低于用其它3种方法测得的糊化起始温度.这与许多研究者的实验结果相符，即淀粉在较低温度下糊化便已经开始.但是众多结论所用的检测指标不一样.Liu等［14］联用 X射线衍射仪(XRD)、DSC和热台偏光显微镜，发现淀粉的结晶度在颗粒还未开始消失之前以及双折射光消失之后都在降低.Wajira等［4，15］为避免淀粉在经历如冷却、干燥和与水再生这些后处理后，结构发生改变而对DSC结果造成影响，在DSC中完成整个保温、冷却预处理过程，结果发现淀粉的相转变在较低温度下(如30℃)便已经发生了.这说明，为更精确地了解淀粉糊化行为信息，应尽可能使用能实时在线检测淀粉糊化的仪器，以减少各种预、后处理对淀粉结构的影响.IOD法可实时在线动态测量淀粉的结晶情况，能够真实、准确地反映糊化过程中具体温度下淀粉的状态，这是XRD分析无法做到的.尽管XRD分析作为测量淀粉结晶度的方法被广泛应用，但是它并不是一种实时在线的测量方法，无法避免各种后处理对原淀粉样品的影响.IOD法重复性较好，DI在糊化前期(小于62℃)及糊化后期(大于70℃)的标准偏差小于1%，在糊化中期(60～68℃)小于5%.

Chiotelli等［16］研究发现，小麦淀粉乳加热过程中，在DSC上有任何可见的吸热现象发生前，储能模量在50℃便开始急剧增加，他们认为这个温度对应淀粉结构中的液晶转换过程(从近晶状向无向性转变)，即双螺旋从微晶上解离的开始.虽然文中实验所用的马铃薯淀粉与小麦淀粉在结构上有所不同，但是马铃薯淀粉更易发生淀粉－水相互作用，在更低的温度下便发生了膨胀［16］.因此，笔者认为IOD法在糊化开始初期测得的淀粉总体结晶程度的降低对应的是淀粉远程有序结构的减小，即淀粉颗粒的膨胀以及双螺旋从微晶一侧脱离，导致结晶程度的部分损失，故IOD法对淀粉结晶程度的变化具有较高的灵敏性.

由图2中的数据计算可知，DSC结果在60℃之后才显示出明显的吸热现象，这个温度对应的是1%淀粉颗粒的膨胀瓦解(数颗粒法)，4.2%结晶部分的消失(面积法)以及6.7%结晶程度的降低(IOD法).在60℃之后，同一温度下4种方法测得的糊化度中DD最小，因为DSC谱图反映的是净吸热焓变过程，这与淀粉吸水膨胀、晶体结构的融化以及交链淀粉的双螺旋解旋等因素有关，体系需要更高的温度推进淀粉糊化过程.进行IOD法和DSC法测得的同一糊化度对应的温度的回归分析，发现两者具有良好的线性相关性(见图3，r2=0.996)，这与Liu等［14］的研究结果相符，他们发现当有足够的水做塑化剂时，双折射结束点温度与DSC得到的转变温度有良好的相关性，淀粉糊化时结晶结构的消失与热转变存在定量关系，因为晶体的融化是伴随热效应而发生的一级结构转变.

图3 同一糊化度下IOD法与DSC法对应的温度之间的关系Fig.3 Relationship between the temperature of IOD method and that of DSC method at the same gelatinization degree

图4显示，糊化进程中对应于同一温度的DI与DD呈对数相关(r2=0.999).DI在10%左右时，DD才开始缓慢增大，当DI大于70%后，DD开始迅速增加.DSC法测得马铃薯淀粉在过量水中的糊化峰值温度为69.1℃，这个温度点对应的DI为72.9%，DD为51.4%.IOD法和DSC法测得的糊化度既相互区别又相互联系.在过量水中，淀粉的DSC谱图显示的单峰是由G峰(螺旋－螺旋解离)和M1峰(支链淀粉双螺旋解离)合并而来的［6］.螺旋－螺旋解离对应的主要是淀粉结晶有序结构的降低，而双螺旋解离则对应于分子有序结构的降低，它们都伴随着吸热过程，两者在过量水中同时发生.IOD值反映的淀粉糊化要比DSC的提前，因为淀粉糊化时结晶结构的减弱要比可检测到的DSC热焓信号更早.随着温度进一步增加，便有了足够的能量来破坏所有剩下的远程有序结构以及分子有序结构.

图4 同一温度下DI与DD的关系Fig.4 Relationship between DIand DDat the same temperature

3 结语

文中提出了一种基于IOD值的用数字图像分析技术动态监测淀粉糊化过程的新方法，它以光波长度约为500nm尺度下淀粉的有序结构为指标，定量得到淀粉在糊化过程中实时的结晶程度变化情况，具有准确、灵敏的特点.IOD法与传统的利用淀粉颗粒结晶双折射特性的方法相比，具有明显的优势，因为它能够对处于部分糊化状态的淀粉颗粒进行表征，同时，它是一种实时监测的方法，免去了各种样品的预、后处理，所以得到的数据能更好地反映样品糊化过程的真实情况.

用IOD法实时监测淀粉糊化过程，特别是在与其它仪器联用时，能够反映出糊化过程中的淀粉结构与性质变化的诸多信息，具有快捷、成本低的特点，是一种值得推广的淀粉糊化研究新方法.

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