氯沙坦对进展性肾炎模型大鼠肾小管-间质细胞巨噬细胞移动抑制因子的影响研究Δ

查艳，赵盈葶，杨霞，陈运芬，俞雷（.贵州省人民医院肾内科，贵阳市550004；2.贵州省电力医院，贵阳市 550004）

氯沙坦（Losartan）是血管紧张素Ⅱ受体1型拮抗药，具有降压和减少尿蛋白的疗效[1]；但其抑制肾小管-间质炎症反应，从而保护肾功能的具体机制目前尚不完全清楚。巨噬细胞（巨噬细胞标记抗原ED-1+的细胞）作为肾组织的主要炎症浸润细胞存在于许多原发和继发性肾脏疾病中，巨噬细胞移动抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF）与肾脏组织学损害、蛋白尿程度及肾功能衰退密切相关[2，3]。因此，笔者在进展性肾炎（Progressive nephritis）大鼠模型[4]中，观察肾小管-间质细胞MIF的表达与间质炎症的相关性，以及给予不同剂量氯沙坦干预后MIF在肾小管-间质细胞中表达的变化，探讨氯沙坦是否可以通过调节MIF的表达来改善肾小管-间质的炎症反应。

1 仪器与材料

1.1 仪器

全自动多功能生化分析仪（日本Hitachi公司）；SN-628放射免疫γ计数仪（中国科学院上海原子核研究所）；光学显微镜、C3040-ADU显微图像分析系统（日本Olympus公司）；LE5001鼠尾无创血压测量仪（美国普升科技有限公司）。

1.2 试药

氯沙坦片（杭州默沙东制药公司，批号：100576，规格：每片50 mg）；小鼠抗大鼠MIF抗体、小鼠抗大鼠ED-1单克隆抗体、鼠单克隆IgG（OX-7）抗Thy1.1抗体（IgG（OX-7）mouse monoclonal anti-Thy1.1 antibody）、正常山羊血清（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；LSAB免疫组织化学（组化）试剂盒（丹麦Dako公司）。

1.3 动物

Wistar大鼠，♂，体重（126.7±10）g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，二级，合格证号：SCXK（渝）2007-0005。

2 方法

2.1 建模与给药[5]

取大鼠行右肾切除并注射鼠单克隆IgG（OX-7）抗Thy1.1抗体2次建立进展性肾炎大鼠模型，于第4周时取部分大鼠立即处死作为模型组，将剩余模型大鼠分为对照组和氯沙坦高、低剂量组（80、20 mg·kg－1·d－1），再另取大鼠行假手术作为假手术组，每组5只，连续给药4周。实验第8周时在麻醉状态下处死剩余所有大鼠，取左肾标本，于－70℃冰箱保存。

2.2 观察指标

2.2.1 MIF、ED-1的免疫组化染色。取10%中性甲醛固定的3µm厚石蜡肾组织切片，常规脱蜡、水化；浸入3%H2O210 min除去内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，每次3～5 min；微波修复抗原，PBS洗3次，每次3～5 min；正常山羊血清封闭10 min，PBS洗3次，每次3～5 min；滴加稀释的一抗鼠单克隆IgG（OX-7）抗Thy1.1抗体（1∶100，V/V），4 ℃过夜，PBS洗3次，每次3～5 min；分别滴加小鼠抗大鼠MIF抗体及小鼠抗大鼠ED-1单克隆抗体（1∶50），室温孵育30 min；二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素轻度复染，以PBS洗3次，每次3～5 min，脱水，透明，封片。检测采用显微图像分析系统对各组染色结果进行积分光密度（IOD）测定，每张切片随机选取10个高倍视野（400倍），每个视野代表0.13 mm2的区域面积，计算其IOD，取平均值作为MIF、ED-1的表达情况。

2.2.2 MIF和ED-1在同一个细胞内的表达检测。采用微波免疫组化双重染色检测，取对照组肾组织切片，第1重染色同“2.2.1”项下“常规脱蜡……4℃过夜，PBS洗3次，每次3～5 min”操作，再滴加小鼠抗大鼠MIF抗体（1∶100稀释），DAB显色，阳性物呈棕色。完成第1重染色后将切片浸人0.01 mmol·L－1、pH6.0的枸橼酸缓冲液中置微波炉加热（800 W）10 min，自然冷却至室温后用PBS洗涤，接着用巨核细胞酶标染色（APAAP）法行第2重染色，滴加小鼠抗大鼠ED-1单克隆抗体（1∶500稀释），再孵育、显色、冲洗后观察阳性物呈紫蓝色。

2.3 统计学处理

采用SPSS 11.3统计软件进行分析。数据用均数±标准差表示，多组均数的比较采用单因素方差分析。相关分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 MIF、ED-1的免疫组化检测结果

3.1.1 MIF的表达。结果表明，假手术组MIF几乎无表达，与其比较，模型组和对照组MIF表达显著升高（P＜0.001），主要集中在肾小管-间质细胞的胞浆。与模型组和对照组比较，氯沙坦高、低剂量组MIF表达明显降低（P＜0.01或P＜0.001）。具体指标详见表1。切片图见图1。

表1 各组大鼠MIF、ED-1表达比较（±s，n＝5）Tab 1 Comparison of MIF and ED-1 in each group（±s，n＝5）

表1 各组大鼠MIF、ED-1表达比较（±s，n＝5）Tab 1 Comparison of MIF and ED-1 in each group（±s，n＝5）

与假手术组比较：＊P＜0.001；与模型组比较：#P＜0.01，##P＜0.001；与对照组比较：ΔP＜0.01，ΔΔP＜0.001vs.sham operation group：＊P＜0.001；vs.model group：#P＜0.01，##P＜0.001；vs.control group：ΔP＜0.01，ΔΔP＜0.001

指标MIF/×103 ED-1/×103假手术组1.81±0.24 1.64±0.13模型组54.28±5.64＊27.96±4.15＊对照组58.79±6.02＊31.47±4.09＊氯沙坦低剂量组24.05±3.18#Δ 4.16±0.52##ΔΔ氯沙坦高剂量组22.64±3.46#Δ 2.32±0.19##ΔΔ

图1 各组大鼠肾组织MIF和ED-1表达的切片图（×200）Fig 1 Slice map of MIF and ED-1 expression of kinedy tissue in each grou（p×200）

3.1.2 ED-1的表达。结果表明，假手术组ED-1几乎无表达，与其比较，模型组和对照组ED-1表达显著升高（P＜0.001），主要集中在肾小管-间质细胞的胞浆。与模型组和对照组比较，氯沙坦高、低剂量组ED-1表达明显降低（P＜0.01或P＜0.001）。具体指标详见表1。切片图见图1。

3.2 MIF和ED-1在同一个细胞内的表达检测结果

MIF（棕色）和ED-1（蓝紫色）同时显色在肾小管-间质细胞的胞浆见图2。

4 讨论

MIF蛋白含114个氨基酸，由α链和β链组成三维晶体结构，其不仅主要由巨噬细胞产生，而且可作用于巨噬细胞，引起巨噬细胞在局部浸润、增生以及刺激巨噬细胞分泌多种细胞因子[6]。MIF的主要生物效应是抑制巨噬细胞的游走，促进巨噬细胞在炎症局部的聚集、增生、活化及分泌一些细胞因子如（白介素（IL）-1、肿瘤坏死因子（TNF）-α），增强炎症反应程度。有研究[7]发现在给大白兔注射肾毒血清的同时腹腔注射抗MIF中和抗体，能有效防止肾组织损害的发生、发展。但MIF在进展性肾炎中的作用及是否能够通过阻断MIF的表达而减轻肾小管间质进行性损害尚未见文献报道。

图2 MIF和ED-1表达在肾小管-间质同一个细胞的切片图（×400）Fig 2 Slice map of MIF and ED-1 expression in same tubulointerstitial cell（×400）

本实验采用免疫组化染色，发现MIF、ED-1在假手术组的肾小管-间质细胞中几乎不表达，在模型组和对照组的肾小管-间质细胞表达明显升高（P＜0.001）。为了检测MIF是否能抑制ED-1向其他组织扩散，本实验采用双重免疫组化染色检测了MIF与ED-1是否在同一个细胞内表达，结果表明MIF和ED-1同时显色于同一个细胞的胞浆。这与既往的报道[6]相一致。经过不同剂量氯沙坦治疗4周后，进展性肾炎模型大鼠肾小管-间质炎症反应明显改善，MIF和ED-1表达明显降低（P＜0.01或P＜0.001）。有研究[8]提示，MIF可以刺激巨噬细胞增生、活化及分泌TNF-α等细胞因子；反过来，TNF-α也可以刺激MIF表达的上调，引起组织学损害。氯沙坦可能通过下调TNF-α的表达，从而抑制了MIF和ED-1在进展性肾炎模型大鼠肾小管-间质细胞中的表达和聚集。其具体的作用机制有待于进一步的探讨。

肾小管-间质细胞的炎症反应也是进展性肾炎的一个主要表现，是预测肾功能下降的重要标志。通过应用氯沙坦抑制肾小管-间质细胞中MIF的表达，可能是早期控制炎症反应，进而防治肾间质纤维化的重要途径之一。

[1] 朱俊峰，郑金聪，刘茂伯.替米沙坦和氯沙坦治疗高血压的Meta分析[J].中国药房，2008，19（29）：2 287.

[2]Nakima K，Tanaka Y，Nomiyama T，et al.RANTES promoter genotype is associated with diabetic nephropathy in type 2 diabetic subjects[J].Diabetes Care，2003，26（3）：892.

[3] 孔耀中，黄英伟.巨噬细胞移动抑制因子在原发性肾小球肾炎组织中的表达和意义[J].中华肾脏病杂志，2000，12（16）：383.

[4] Matsumoto M.Hypoperfusion of peritubular capillaries induces chronic hypoxia before progression of tubulointerstitial injury in a progressive model of rat glomerulonephritis[J].J Am Soc Nephrol，2004，15（6）：1 574.

[5] 查 艳，何平红，龙艳君，等.氯沙坦对进展性肾炎模型大鼠肾小管-间质细胞低氧诱导因子及结缔组织生长因子的影响研究[J].中国药房，2011，22（29）：2 711.

[6] Rice E，Tesch G，Mark S，et al.Induction of MIF synthesis and secretion by tubular epithelial cells：a novel action of angiotonsin Ⅱ[J].Kidney Int，2006，63（4）：1 265.

[7] Foote A，Brlganti EM，Kipen Y，et al.Macmphage migration inhibitory factor in systemic lupus erythematosus[J].J Rheumatol，2009，62（7）：268.

[8] Lan HY，Yang N，Hui W，et al.TNF-alpha up-regulates renal MIF expression in rat cresentic glomerulonephritis[J].Mal Med，2008，52（3）：136.