归芪甘草汤对小鼠免疫功能的影响

林云成，武 瑞，王跃强，吴国军，郭婷婷，韩 旭

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

近年来，畜禽免疫抑制性疾病给养殖业带来巨大危害，因此，人们越来越重视通过应用免疫增强剂来提高畜禽机体抗病力。免疫增强剂主要分为化学合成小分子、微生物制剂、生物制剂和中草药等［1］。其中，中草药因具有资源丰富、价格低廉、毒副作用小、作用广泛等优点而备受青睐［2］。中药免疫增强剂的研究与开发具有广阔的应用前景，但其作用机制尚不清楚。本试验旨在通过检测昆明系小鼠免疫指标，探讨归芪甘草汤的作用途径和机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物 6周龄昆明系小鼠120只，体重18～22g，雌雄各半，成年豚鼠3只，均购自长春生物制品研究所。公鸡1只，市售。

1.2 试验材料 归芪甘草汤（由黄芪、当归、炙甘草、熟地和党参组成，通过传统水煎法获得复方药液，浓缩为含生药量1g／mL）；免疫抑制剂环磷酰胺（Cy，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：10011121）为3mg／mL的注射液；CD4／CD8荧光抗体（购于Miltenyi Biotec公司）；Alsever＇s溶液；鸡红细胞悬液和补体制备［3］。

1.3 试验主要仪器 XSP-18S光学显微镜（南京江南永新光学有限公司）；Z36HK高速冷冻离心机（德国Hermle公司）；Aira分选式流式细胞仪（美国BD公司）；V-5100可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）。

1.4 试验设计与内容 选择6周龄昆明系小鼠120只，预饲2d后，随机分为4组（即对照Ⅰ组、试验Ⅰ组、对照Ⅱ组和试验Ⅱ组），每组30只小鼠，雌雄各半。分别进行健康动物复方中药应用试验（试验Ⅰ组小鼠每日每只灌服0.5mL复方中药，对照Ⅰ组小鼠每日每只灌服等量蒸馏水）和免疫抑制动物复方中药应用试验（对照Ⅱ组和试验Ⅱ组小鼠，在试验第3、5、7、9天均腹腔注射浓度为3mg／mL的免疫抑制剂0.5mL，复制小鼠免疫抑制模型；在复制模型的同时，试验Ⅱ组小鼠每日每只灌服0.5mL复方中药，对照Ⅱ组小鼠灌服等量蒸馏水）。

1.4.1 小鼠T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+的检测 在试验第15天，每组取10只小鼠放血处死取脾脏。用红细胞裂解液（ACK）反复裂解脾脏内红细胞，当脾脏T淋巴细胞容积恒定后，用PBS洗除ACK，并将T淋巴细胞稀释为2×106cells／mL细胞悬液。取500μL细胞悬液，同时加入CD4+、CD8+荧光抗体各8μL，4℃避光孵育30min后，上流式细胞仪进行检测。

1.4.2 小鼠B淋巴细胞IgM的检测 在试验第8天，每组取10只小鼠腹腔注射5%生理盐水鸡血红细胞悬液0.2mL进行免疫，做好标记，专用于IgM的检测。在试验第15天，小鼠眼球框静脉插管取血，应用比色法测定光密度［3］。

1.4.3 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的检测 在试验第15天灌服复方中药4h后，每组取10只小鼠腹腔注射3%鸡血红细胞悬液0.5mL，2h后脱颈处死小鼠，腹腔注入生理盐水2mL，轻揉小鼠腹部，吸取腹腔冲洗液，滴片，自然晾干后用瑞氏染色，显微镜观察，计算巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数［3］。

1.4.4 数据处理 采用SPSS 17.0软件对所得试验数据进行单因素方差分析，用平均值±标准差表示试验结果，采用LSD进行差异显著性分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著，P＞0.05为差异不显著。

2 结果

2.1 归芪甘草汤对小鼠CD4+和CD8+的影响 见表1。

表1 归芪甘草汤对小鼠T淋巴细胞表面分子CD4＋%、CD8＋%及CD4＋／CD8＋的影响（n=10）

表1 归芪甘草汤对小鼠T淋巴细胞表面分子CD4＋%、CD8＋%及CD4＋／CD8＋的影响（n=10）

注：不同的小写字母表示差异显著（P＜0.05）；不同的大写字母表示差异极显著（P＜0.01）。下表同

2.2 归芪甘草汤对小鼠B淋巴细胞IgM的影响 见表2。

表2 归芪甘草汤对小鼠B淋巴细胞IgM的影响（n=10，）

表2 归芪甘草汤对小鼠B淋巴细胞IgM的影响（n=10，）

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2.3 归芪甘草汤对小鼠巨噬细胞功能的影响 见表3。

表3 归芪甘草汤对试验小鼠巨噬细胞功能的影响（n=10，）

表3 归芪甘草汤对试验小鼠巨噬细胞功能的影响（n=10，）

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3 分析与讨论

T淋巴细胞在机体特异性细胞免疫中发挥重要的作用。CD4和CD8是T淋巴细胞表面重要亚群，它们会在成熟T淋巴细胞表面表达CD4+（TH细胞）和CD8+（TC细胞）；TH细胞分泌的细胞因子可以促进T、B细胞免疫应答，TC细胞分泌的细胞因子具有免疫抑制和细胞毒性作用［4］；当机体细胞免疫功能正常时，CD4+／CD8+处于恒定范围；因此，可以通过检测T淋巴细胞表面亚群CD4+／CD8+来了解机体细胞免疫功能。试验结果表明，对健康小鼠，灌服复方中药和灌服蒸馏水的小鼠CD4+／CD8+差异不显著（P＞0.05），这说明健康小鼠CD4+／CD8+处于动态平衡；对免疫抑制小鼠，灌服复方中药和灌服蒸馏水的小鼠CD4+／CD8+差异极显著（P＜0.01），这说明复方中药可以有效增强免疫功能受损小鼠的细胞免疫功能。

溶血素（IgM）是B淋巴细胞产生最早的免疫球蛋白分子，也是在B淋巴细胞表面表达最早的抗体，在人工免疫或病原体感染后，它将最早产生，因此血清中IgM含量检测可作为评价体液免疫功能之一［5］。试验结果表明，无论是健康小鼠还是免疫抑制小鼠，灌服复方中药后，其OD值均高于灌服蒸馏水小鼠，这说明复方中药具有提高小鼠IgM含量，增强小鼠体液免疫功能的作用。

巨噬细胞是机体非特异性免疫的重要组成部分，具有吞噬、杀伤、抗原递呈、分泌生物活性物质、调控局部组织微环境以及抑制肿瘤等多种免疫功能。试验结果表明，灌服中药的健康小鼠和免疫抑制小鼠巨噬细胞功能均比灌服蒸馏水小鼠强，这说明复方中药可以增强小鼠腹腔巨噬细胞功能。

4 结语

综上所述，本复方中药提取液可以增强昆明系小鼠的免疫功能，尤其是对免疫抑制小鼠的免疫功能增强更为明显。因此，研究开发动物专用的中药免疫增强剂具有实际意义和广阔的应用前景。

［1］段若竹，吴剑波.免疫增强剂的研究应用及展望［J］.国外医药：抗生素分册，2006，27（2）：54-57.

［2］曹礼华，刘家国.中药对机体免疫功能影响研究进展［J］.中兽医医药杂志，2008，（3）：28-30.

［3］谢仲权，牛树琦，刘凤华.天然中草药饲料添加剂研究方法［M］.北京：中国农业科技出版社，2001：87-88.

［4］韩爱云.热应激对肉鸡淋巴细胞钙信号转导的影响及铬的调控作用［M］.北京：中国农业科学院，2010：18.

［5］崔治中，崔保安.兽医免疫学［M］.北京：中国农业出版社，2004：44.