CFTR及SPINK1蛋白在慢性胰腺炎及胰腺癌中的表达及其意义

张 敏,王银萍,倪劲松,薛世泉,邹亚彬,张丽红

(1.吉林大学白求恩医学院病理生物学教育部重点实验室,吉林长春 130021;2.吉林大学第一临床医院 病理科,吉林 长春 130021）

慢性胰腺炎是一种以胰腺进行性炎症和纤维化为特征,最终引起胰腺结构和功能永久性破坏的疾病,慢性胰腺炎明确诊断20年后往往发展成为胰腺癌。慢性胰腺炎及胰腺癌病因复杂,遗传基因异常在二者发病中的作用成为国内外研究的热点,但目前尚无一致性定论。囊性纤维跨膜转运调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR）及丝氨酸蛋白酶抑制剂 Kazal 1型(Serine protease inhibitor Kazal type 1,SPINK1）,是新近发现的与慢性胰腺炎及胰腺癌相关的两种基因蛋白。CFTR是一种氯离子通道蛋白,调节Na--Cl-交换。SPINK1是一种胰蛋白酶抑制剂。国外研究者已发现CFTR及SPINK1基因突变及多态性与慢性胰腺炎密切相关。本研究通过免疫组织化学染色方法检测了CFTR及SPINK1蛋白在慢性胰腺炎及胰腺癌中的表达,为慢性胰腺炎及胰腺癌的防治从基因水平上开辟新途径提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本

慢性胰腺炎石蜡标本20例,男性12例,女性8例。患者年龄从 37-75岁,平均年龄为(43.3±11.6）岁。胰腺导管腺癌石蜡标本30例,男性20例,女性10例。患者年龄范围50-75岁,平均年龄为(56±5.6）岁。正常胰腺组织标本10例,均为临床进行Whipple手术切除所带的胰腺组织,其中男性7例,女性3例,年龄56-73岁,平均年龄(65±5.3）岁。所有标本均经病理医师复查,诊断无误。

1.1.2 试剂

CFTR及SPINK1单克隆抗体(兔抗人）购于北京吉奥众艺生物有限公司,SP免疫组化试剂盒和DAB显色液购于福州迈新生物技术有限公司,FITC标记的荧光二抗购于长春鼎国生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色方法

采用SP染色法免疫组化,实验步骤按SP试剂盒说明书进行,以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.2 结果判定

CFTR以胰腺导管上皮细胞膜和细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性表达,每例随机选取5个400倍视野观察。采用染色强度和阳性细胞百分比双重判定进行评分,并将二者评分乘积作为最终评分进行统计学分析。具体评分标准如下:染色强度判定:基本不着色为0分,着色弱为1分,中度着色为2分,着色强为3分;阳性细胞比例的判定:着色细胞占总细胞数的百分比＜10%为0分,10%-25%为1分,26%-50%为2分,51%-75%为3分,＞75%为4分。最后以阳性细胞的百分比得分和染色强度得分乘积做为最终结果进行判定。0分为阴性(-）,1-4分为弱阳性(+）,5-8分为阳性(++）,9-12分为强阳性(+++）,本文中所统计阳性率以+-+++作为阳性计算。

2 结果

2.1 CFTR蛋白的表达

正常胰腺对照组中几乎所有的胰腺导管上皮细胞均可见阳性表达,阳性反应主要定位于细胞质中,少数定位于胞膜,为棕黄色细颗粒状(图1）,阳性率为100%。部分慢性胰腺炎中胰腺导管上皮细胞可见表达,阳性反应主要定位于细胞质(图2）。阳性表达率为50%。胰腺导管癌细胞中偶见表达(图3,图4）,阳性表达率为10%。结果显示,慢性胰腺炎及胰腺癌组表达结果均低于正常对照组,经 χ2检验,P＜0.05,组间差异显著;胰腺导管癌组明显低于慢性胰腺炎组(P＜0.05）(见表1）。

图1 CFTR在正常胰腺组织中呈阳性表达400×

表1 CFTR在正常胰腺组织、慢性胰腺炎及胰腺癌中的表达

2.2 SPINK1蛋白的表达

正常胰腺对照组中在几乎所有的胰腺腺泡细胞及胰管上皮内均可见阳性表达,SPINK1的阳性反应主要定位于细胞质中(图5）,阳性率为100%。慢性胰腺炎组织中腺泡细胞及胰腺导管细胞的胞质可见表达(图6）,阳性率为55%。胰腺癌细胞中偶见表达,主要定位于细胞核(图7,8）,阳性率为6.7%。结果显示,慢性胰腺炎及胰腺癌组表达结果均低于正常对照组,经 χ2检验,P＜0.05,组间差异显著;胰腺导管癌组明显低于慢性胰腺炎组(P＜0.05）详见表2。

图3 CFTR在高分化胰腺癌中呈弱表达400×

图4 CFTR在低分化胰腺癌中呈弱表达400×

图5 SPINK1在正常胰腺组织中呈强阳性表达400×

图6 SPNK1在慢性胰腺炎中呈弱阳性表达400×

图7 SPINK1在高分化导管癌中呈弱表达400×

图8 SPINK1在低分化胰腺导管癌中呈弱表达400×

表2 SPINK1蛋白在正常胰腺,慢性胰腺炎及胰腺癌中的表达

3 讨论

CFTR是分布于胰腺、肠道及胆管等部位上皮细胞游离膜上的一种氯离子通道,它在跨上皮盐类的转运、水份流动和离子浓度调节中发挥重要作用[1-3]。异常CFTR可能导致经由上皮层的液体转运发生改变[4],细胞无法进行正常分泌活动,导致水分流失和分泌物粘稠,从而引起局部组织的阻塞和感染。

SPINK1又称胰分泌性胰蛋白酶抑制剂Kazal 1型,正常状态下,SPINK1-胰蛋白酶复合物一起分泌入胰管,到达小肠后SPINK1分离或降解,胰蛋白酶抑制解除[5]。众所周知,胰腺炎的发生与胰蛋白酶原的异常激活有关,所以SPINK1蛋白在胰腺炎发病过程中可能充当的是对抗激活的胰蛋白酶原的第一线保护机制[6]。

3.1 CFTR蛋白在慢性胰腺炎和胰腺癌中的表达及其意义

本实验结果显示,CFTR蛋白在慢性胰腺炎和胰腺癌中呈弱表达,明显弱于正常的胰腺组织。可见CFTR蛋白在慢性胰腺炎和胰腺癌中表达丢失,这种表达异常可能与二者的发生及发展存在着一定关系。由于CFTR功能不全,离子分泌障碍,导致分泌液PH值下降。酸性环境在引起组织炎症损害的同时,还会导致胰酶分泌及激活的异常,最终导致胰腺的纤维化及功能不全[7]。Smith[8]认为较低离子浓度是机体保持消灭微生物能力的一个重要因素,而CFTR表达异常时氯化钠浓度较高,机体清除病原体能力下降,这也是机体感染的一个重要原因。推测CFTR蛋白表达异常时,分泌的胰液浓缩而阻塞胰腺导管使其抗感染能力下降,最终导致慢性炎症的发生。CFTR蛋白的缺失改变了胰腺细胞内的PH值,而PH值的变化又影响细胞的分化增殖及细胞周期[9]。

3.2 SPINK1蛋白在慢性胰腺炎及胰腺癌中的表达及其意义

本实验中SPINK1蛋白在慢性胰腺炎组中的表达显著低于正常胰腺组,提示由于SPINK1蛋白表达的降低,失去了对胰蛋白酶的抑制作用而导致胰腺炎症的发生,这与Witt等[10]研究的SPINK1基因突变与慢性胰腺炎相关性的结果相似。本研究结果显示,SPINK1蛋白在胰腺癌中的表达显著低于正常胰腺组及慢性胰腺炎组。表达部位及强度的改变,提示SPINK1蛋白的异常表达可能参与了慢性胰腺炎向胰腺癌的发展过程。推测在慢性胰腺炎向胰腺癌的发展过程中,SPINK1蛋白可能是作为一种致病因子或一种修饰因子,降低了胰腺癌发病的阈值或是与其他的基因蛋白一起促进了胰腺癌的发生,也可能由于细胞发生癌变导致SPINK1蛋白表达部位及强度的变化。

综上所述,通过对CFTR和SPINK1蛋白在慢性胰腺炎及胰腺癌中的表达情况分析,推测两种蛋白表达的异常与慢性胰腺炎及胰腺癌的发生有一定关系,亦可能是作为一种附加因素与其他致病因素共同作用导致慢性胰腺炎及胰腺癌的发生。本次研究为胰腺疾病复杂病因的探索开拓了新思路,随着研究的深入必将进一步明确胰腺疾病的病因,为胰腺炎及胰腺癌诊断、防治提供新的策略。

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[10]Witt H,LuckW,HenniesHC,et alMutations in the gene encoding the serine protease inhibitor,Kazal type 1 are associatedwith chronic pancreatitis[M].Nat Genet,2000,25(2）:213.