骨髓移植小鼠二甲基亚硝胺肝纤维化模型的建立

刘志强，陆 雄，刘成海，王晓玲，吕 靖，袁 琳，胡 娜

(1.上海中医药大学科技实验中心，上海 201203;2.上海中医药大学肝病研究所，上海 201203;3.上海中医药大学基础医学院，上海 201203)

骨髓移植小鼠二甲基亚硝胺肝纤维化模型的建立

刘志强1，陆 雄1，刘成海2，王晓玲3，吕 靖2，袁 琳1，胡 娜1

(1.上海中医药大学科技实验中心，上海 201203;2.上海中医药大学肝病研究所，上海 201203;3.上海中医药大学基础医学院，上海 201203)

目的 构建绿色荧光蛋白(GFP)标记骨髓细胞的小鼠，并复制其二甲基亚硝胺(DMN)肝纤维化模型。方法 ICR雄性小鼠32只，随机分为正常组6只和移植组26只。移植组接受致死量γ射线照射后，经尾静脉输入GFP转基因小鼠的骨髓细胞;正常组不进行照射和移植，仅尾静脉注射等量生理盐水。两个月后制备血涂片，观察移植组造血重建情况，造血重建动物再分为对照组和造模组，造模组用DMN按每次10mg/kg体重腹腔注射制备肝纤维化模型，隔日一次，正常组和对照组给予等量生理盐水。设染毒后3周和4周两个时间观察点，生化法测定肝功能;Jamall法检测肝组织羟脯氨酸含量;HE染色及天狼猩红染色观察肝组织炎症、坏死及纤维组织增生情况;GFP免疫荧光组织化学观察骨髓源性细胞在肝脏的归巢特点。结果 骨髓移植两个月后，移植组外周血中出现满视野GFP+细胞。与正常组比较，两个时间观察点造模组肝功能(ALT、AST、Alb及T.Bil)均明显异常(P＜0.05)，肝组织羟脯氨酸含量显著增高(P＜0.05)，造模3周末肝组织出血性坏死，有炎性细胞浸润，但尚未形成完全的纤维间隔;造模4周末肝组织炎症、坏死程度加重，可见完全的纤维间隔，在DMN造模动物肝组织内发现较多GFP+细胞。结论 腹腔注射二甲基亚硝胺，隔日1次，每次10 mg/kg体重，共4周，可使造血重建小鼠形成显著肝纤维化。本模型的建立为研究骨髓源性细胞在肝纤维化过程中的肝内归巢和分化，以及药物干预对其归巢和分化的影响提供了一个技术平台。

骨髓源性细胞;移植;二甲基亚硝胺;肝纤维化;模型

干细胞从上个世纪末开始成为生物医学领域中的研究热点，科学杂志评出1999年的十大进展，干细胞研究名列首位。干细胞是指体内一类具有多向分化潜能的细胞，能多向分化和自我复制，在特定条件下，它可以分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官［1-3］。按其分化阶段的不同，干细胞大致可分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和成体干细胞(somatic stem cell，SSC)两类。胚胎干细胞是已知的分化潜能最广的一类干细胞，可以分化成各种组织细胞，但因涉及伦理问题，在应用中颇受争议。人和动物成熟组织中也存在一些尚未分化的干细胞，称为成体干细胞。其中，骨髓中含有丰富的干细胞，因其较少涉及伦理问题而受到科学家们的重视。传统观点认为，干细胞的分化具有谱系限定性和器官特异性，但最近的研究发现，无论人类还是鼠类的骨髓干细胞都能跨越谱系界限分化成其他组织的细胞，并表达这些组织特异性的蛋白，如心、肝、脑、骨骼肌和血管内皮，干细胞这种跨谱系分化的能力称为可塑性。骨髓干细胞的可塑性也引起了肝脏病学者的研究兴趣。近年的研究表明骨髓干细胞可向肝实质细胞分化［3-5］，促进肝脏损伤的修复。通过研究，人们发现骨髓干细胞还可以向肝窦内皮细胞［6］、库普否细胞［7］、星状细胞及肌成纤维母细胞［8-11］分化，这方面的研究为肝脏病的治疗提供了新的思路。为研究骨髓干细胞在肝纤维化过程中的肝内归巢及分化，本文拟建立一种可靠的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4～6周龄ICR绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)转基因小鼠 15 只，体质量20 ～30 g，由上海肿瘤所提供，上海中医药大学实验动物中心繁殖。6周龄清洁级ICR雄性小鼠32只，体质量28～30 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司【SCXK(沪)2007-0005】。上海中医药大学实验动物中心饲养、造模和观察，自由饮食。

1.2 主要试剂

二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，DMN，Lot：DPP3372)，购自和光纯药工业株式会社。血清肝功能试剂盒，包括丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransaminase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、白蛋白(albumin，Alb)及总胆红素(total bilirubin，T.Bil)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)标准品，分析纯，购自日本ナヌライウスク株式会社。小鼠抗 GFP单抗(mouse anti GFP，Abcam)，FITC标记的山羊抗小鼠荧光二抗(goat anti mouse IgG/FITC，Invitrogen)。DAPI购自碧云天生物技术研究所。

1.3 动物分组

6周龄清洁级ICR雄性小鼠共32只，随机分为正常组6只和移植组26只。正常组不进行照射和骨髓移植;移植组全身均匀接受137 Cs照射(总剂量6.5 Gy)，照射后 6h内，进行骨髓移植。两个月后制备血涂片，观察移植组动物造血重建情况，将造血重建动物再分为对照组和造模组。造模组腹腔注射DMN，正常组和对照组给予等量生理盐水。造模动物设染毒后3周和4周共2个时间观察点。

1.4 骨髓移植模型的建立

1.4.1 骨髓细胞的获取：ICR绿色荧光蛋白转基因小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡约1～5 min，无菌条件下分离出小鼠的胫骨和股骨，放入装有1640细胞培养液的平皿中。剪刀剪去胫骨和股骨两端的骨皮质，用1 mL注射器7号针头反复冲洗骨髓腔，将骨髓冲出。经尼龙膜过滤制成单细胞悬液，加入红细胞裂解液，1500 r/min离心10 min，去上清。经含2%胎牛血清的1640细胞培养液洗涤两次后，再用无胎牛血清的1640细胞培养液调整骨髓细胞的浓度，使骨髓细胞的最终浓度为5×107/mL。

1.4.2 骨髓细胞移植：移植当日移植组小鼠全身均匀接受137 Cs照射(总剂量6.5 Gy)。照射后6 h内，以1 mL注射器经尾静脉按每只0.2mL注射供体小鼠骨髓细胞悬液。移植后受体小鼠饮用含庆大霉素的抗生素溶液2周。正常组不进行照射和移植，仅尾静脉注射等量生理盐水。

1.5 肝纤维化模型制备

骨髓移植2个月后，建立二甲基亚硝胺(DMN)肝纤维化模型。造模组用DMN 10 mg/kg体重，即0.1%DMN溶液10 mL/kg腹腔注射，隔日一次。正常组和对照组同法给予等剂量生理盐水。分别于3周末(注射10次)和4周末(注射14次)两个时间观察点取材，观察肝脏损伤情况。

1.6 观测样品的采集与处理

小鼠摘眼球取血，3000 r/min×15 min离心，收集血清，-80℃保存。取0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm大小肝组织两块，一块以4%甲醛固定，24 h后逐级乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋;另一块用OCT胶包埋，液氮速冻后，-80℃保存。剩余肝组织装1.5 mL离心管，-80℃保存。

1.7 血清肝功能测定

血清 ALT活性：赖氏法;血清 AST活性：赖氏法;血清Alb含量：溴甲酚绿法;血清T.Bil含量：苯甲酸钠-咖啡因比色法。

1.8 肝组织羟脯氨酸含量测定

采用 Jamall氏法测定［12］。称取100 mg左右湿肝，加入盛有2.5 mL蒸馏水的安瓿瓶中，加2.5 mL 12 mol/L HCl，105℃ 水解 20 h。过滤，取水解液100 μL，每个样本做复管，40℃烘干。分别取 Hyp标准溶液(0.0l μg/μL)0、20、40、60、80、120、160 μL，加50%异丙醇至1.2 mL，再加氯氨-T溶液0.2 mL，混匀，室温放置 10 min，加入 ER工作液［25%(w/v)对二甲基氨基甲苯、27.3%(v/v)高氯酸的异丙醇溶液］l mL，振荡混匀，50℃水浴箱温浴90 min，在558 nm波长下比色，计算标准曲线。同上反应系中以样本代替Hyp标准品，读取A558。依据标准曲线计算羟脯氨酸含量。

1.9 肝组织病理染色

肝组织石蜡切片厚度为4 μm，二甲苯透明，梯度乙醇脱蜡至水，HE染色观察肝组织病理形态学变化;天狼猩红胶原染色，观察肝组织纤维增生程度。

1.10 GFP免疫荧光组织化学

1.1 0.1 GFP表达测定：肝组织冰冻切片厚度为6 μm，冰丙酮固定 10 min，胎牛血清 37℃ 封闭30 min，加一抗(1∶400)，4℃ 过夜，再加二抗(1∶800)，37℃孵育 1 h，DAPI染核 1 min，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察。PBS(pH 7.4)代替一抗做阴性对照染色。

1.1 0.2 图像半定量分析：TMT i-solution Version 8.5图像分析软件，序列号：616974457。每组各取3个动物肝脏标本做免疫荧光组织化学染色，每张切片随机选择4个不重叠视野，在40×10放大倍数下，测定GFP阳性区域的面积比。

1.11 统计学处理

计量资料用(¯x±s)表示，并用统计软件SPSS16.0中的ANOVA程序进行单因素方差分析，并用LSD程序进行两两比较。

2 结果

2.1 骨髓移植后动物情况

移植组动物于移植后共死亡5只，死亡率为19.2%;正常组未出现死亡。移植两个月后，血涂片发现在移植组动物的外周血中有大量的GFP+细胞;正常组外周血中未发现GFP+细胞。见图1(彩插1)。

2.2 DMN造模后动物情况

2.2.1 一般情况：DMN造模组动物精神萎靡，毛色暗淡，体重逐渐下降，从造模第2周起即与对照组比较出现显著差异(P＜0.01)。3周内造模组动物未出现死亡，1只动物出现腹水。4周末造模组2只腹水，死亡1只。各组一般情况比较。见表1。

2.2.2 肝功能：造模组血清 ALT、AST及 T.Bil于3周末时即明显高于正常组(P＜0.01)，而 Alb明显降低(P＜0.01)。4周末时这种趋势更加明显。与正常组比较，对照组未见明显差异(P＞0.05)。见表2。

2.2.3 肝组织羟脯氨酸：两个时间观察点造模组肝组织羟脯氨酸含量均明显高于正常组(P＜0.01)。与正常组比较，对照组未见明显差异(P＞0.05)。见表3。

表1 各组动物一般情况比较(s)Tab.1Comparison of the mice in each group(s)

表1 各组动物一般情况比较(s)Tab.1Comparison of the mice in each group(s)

注：与正常组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。Note：compared with the normal group，*P ＜0.05，**P ＜0.01.

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表2 各组动物血清ALT、AST、Alb及T.Bil含量的动态变化(s)Tab.1Dynamic changes of serum ALT，AST，Alb，and T.Bil levels in each group(s)

表2 各组动物血清ALT、AST、Alb及T.Bil含量的动态变化(s)Tab.1Dynamic changes of serum ALT，AST，Alb，and T.Bil levels in each group(s)

注：与正常组比较，**P＜0.01。Note：compared with the normal group，**P ＜0.01.

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表3 各组肝组织羟脯氨含量的动态变化(s)Tab.1 Changes of hydroxyproline levels in the liver tissues(s)

表3 各组肝组织羟脯氨含量的动态变化(s)Tab.1 Changes of hydroxyproline levels in the liver tissues(s)

注：与正常组比较，**P＜0.01。Note：compared with the normal group，**P ＜0.01.

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2.2.4 病理切片(HE染色)：正常组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞束排列整齐，细胞无变性、坏死改变，肝实质内未见炎性细胞浸润，对照组基本同正常组。造模3周末肝组织广泛出血性坏死并见大量肿胀肝细胞，有炎症细胞浸润。造模4周末肝组织变性、坏死程度加重，广泛桥接坏死，大量炎症细胞浸润。汇管区明显增厚，有较厚的纤维间隔伸入小叶坏死区，形成假小叶。见图2(彩插2)。

2.2.5 天狼猩红胶原染色：正常组和对照组仅在汇管区及中央静脉壁见少量胶原纤维。造模3周末汇管区纤维组织增厚，有较粗的纤维束向肝小叶放散，但尚未形成完全的纤维间隔。造模4周末胶原组织增生更加明显，个别区域已形成完全的纤维间隔。见图3(彩插2)。

2.2.6 GFP免疫荧光染色：阴性对照未见阳性染色。正常组未发现 GFP+细胞;对照组仅有少量GFP+细胞;造模组GFP+细胞显著增多，且随着造模的进行有增多趋势(见图4，见彩插1)。高倍镜下(400×)GFP阳性区域的面积比，见表4。

3 讨论

骨髓干细胞具有很强的自我复制能力和多向分化潜能，在肝脏疾病治疗中的应用逐渐为人们所关注。进行有效的细胞标记是进一步研究干细胞定向分化、治疗效果、探讨治疗机制的前提。因此，寻找一种稳定直观而又不影响细胞活力的标记方法，尤为重要。目前常用的标记方法主要有DAPI标记法、BrdU标记法、染色体标记法以及基因标记法［13-16］。DAPI是一种可与DNA特异性结合的荧光染料，多用于细胞生物学和细胞遗传学的研究。BrdU标记法存在只能标记增殖期细胞，标记细胞不能直接观察等不足。染色体标记法主要将雄性供体动物细胞移植到雌性动物体内，通过Y染色体杂交区别确认移植细胞。其优点在于可终生标记，但对实验技术要求较高，操作繁琐等不足。基因标记法通过基因转染或直接从转基因动物取材，使被标记细胞携带表达GFP或其他蛋白的基因。

表4 高倍镜下(400×)GFP阳性区域的面积比(n=3，s)Tab.4 GFP-positive area ratio analyzed under high microscopic magnification(400×)

表4 高倍镜下(400×)GFP阳性区域的面积比(n=3，s)Tab.4 GFP-positive area ratio analyzed under high microscopic magnification(400×)

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P ＜0.01。Note：compared with the normal group，* P ＜0.05，**P ＜0.01

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GFP是一种自发荧光蛋白，该蛋白在蓝色光激发下可自发绿色荧光。其性质稳定，分子量小，大量表达对细胞无毒性［17］。绿色荧光蛋白转基因小鼠组织细胞的自发荧光特性可以稳定遗传，骨髓或干细胞移植后可以有效地追踪干细胞的分化方向［18］。实验中，我们将绿色荧光蛋白转基因小鼠的骨髓细胞移植给全身接受致死剂量γ射线照射的同品系小鼠，移植2个月后，外周血细胞计数显示骨髓造血基本恢复正常，荧光显微镜观察，有满视野的GFP+细胞，在DMN造模4周末无消减，提示供体骨髓细胞植入稳定。

二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)是一种具有肝毒性和细胞毒性的诱导剂，是经典的药物性肝损害造模药物，采用二甲基亚硝胺制作实验性肝纤维化模型已有40余年历史。DMN致肝纤维化的机理［19］，主要是DMN经微粒体转化，引起核酸与蛋白质的甲基化从而导致肝细胞坏死，刺激合成细胞外基质，导致肝纤维化。DMN法多以腹腔注射途径造模［20］。每周连续腹腔注射3天，每次10 mg/kg体重剂量，共4周是大鼠常用的DMN肝纤维化造模方法。之前我们按同样的方法腹腔注射骨髓移植后的ICR小鼠，结果造模一周内即有大批动物死亡，一周死亡率为55.4%。本次实验我们参考有关文献［21］，在DMN单次剂量不变的情况下，采用隔日注射的方法，明显降低了动物死亡率，造模4周后模型动物肝功能明显异常，肝组织羟脯氨酸含量显著升高。病理观察可见肝组织广泛出血性坏死并见大量变性肝细胞，有炎症细胞浸润。胶原纤维大量增生，有些区域已形成完全的纤维间隔。提示用DMN按每次10mg/kg体重腹腔注射，隔日一次，共4周可成功制备肝纤维化小鼠模型。为了研究骨髓源性细胞是否向肝脏归巢，我们采用 GFP荧光免疫组化及DAPI染核的方法进行检测，结果发现未经DMN造模的对照组动物肝组织仅有少量GFP+细胞;DMN造模组动物肝组织GFP+细胞显著增多，且随着造模的进行有增多趋势。

本实验成功构建了绿色荧光蛋白标记骨髓细胞的小鼠，并复制了其二甲基亚硝胺肝纤维化模型。本模型的建立为研究骨髓源性细胞在肝纤维化过程中的肝内归巢和分化，以及药物干预对其归巢和分化的影响提供了一个技术平台。这一领域的研究将为发现肝硬化治疗的药物新靶标奠定基础，为各种肝脏疾病的细胞治疗提供新的思路和方法。

(本文图 1，4见彩插1，图 2，3见彩插 2)。

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Establishment of a mouse model of DMN-induced hepatic fibrosis after bone marrow transplantation

LIU Zhi-qiang1，LU Xiong1，LIU Cheng-hai2，WANG Xiao-ling3，LV Jing2，YUAN Lin1，HU Na1
(1.Experiment Center for Science and Technology;2.Institute of Liver Diseases，3.Department of Biology，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China)

Objective To establish a model of hepatic fibrosis in mice labeling bone marrow cells with green fluorescent protein(GFP).Methods Thirty-two ICR mice were randomly divided into normal group and transplantation group.The mice in the transplantation group were lethally irradiated and

bone marrow transplants from GFP transgenic ICR mice.The normal group was not irradiated and transplanted.Blood smear was prepared and examined after two months.The hematopoietic reconstitution animals were further divided into control and model subgroups.The mice in the model group were injected intraperitoneally with dimethylnitrosamine(DMN)in a dose of 10 mg/kg every other day.The normal group and the control group received only normal saline.All groups were observed at 3 w and 4 w after DMN intoxication.The levels of ALT，AST，Alb and T.Bil were examined by commercial kits，respectively.The contents of hepatic hydroxyproline were measured by Jamall’s method.Liver inflammation and collagen deposition were evaluated by histological examination with HE and Sirius red staining，respectively.Homing of bone marrow-derived cells was detected by GFP immunofluorescence staining.Results Two months after transplantation，GFP+cells appeared in the peripheral blood of transplanted mice.A significant hepatic fibrosis could be found after DMN intoxication for 4 weeks.With the aggravation ofliver fibrosis，the number of GFP+cells homing to the liver was gradually increased.Conclusions Intraperitoneal injection of DMN every other day in a dose of 10 mg/kg for 4 weeks can induce a significant liver fibrosis.Bone marrow transplantation may reconstruct the hematopoietic system in irradiated animals without significant liver damage.With the progress of liver fibrosis，there are bone marrow-derived cells homing to the liver tissue.The establishment of this model provides a technical platform for the study of bone marrow-derived stem cells homing and differentiation in the process of hepatic fibrosis，as well as drug intervention for their homing and differentiation.

Bone marrow-derived cell;Transplantation;Dimethylnitrosamine;Hepatic fibrosis;Model;Mouse

R-33

A

1005-4847(2011)01-0016-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.004

上海市优秀学科带头人计划(编号：08XD14041)。

刘志强(1983-)，男，研究方向：中医药抗肝纤维化的研究。Email：zhiqiangtcm@163.com

陆雄。Email：xionglu93@hotmail.com

2010-06-17