HPLC 法测定头花蓼中槲皮素与山奈酚的含量

李雨生，王祥培，万德光，吴红梅

头花蓼为蓼科植物头花蓼(Polygonum capitatum Buch．—Han．ex D．Don)的干燥全草或地上部分，主产于贵州、云南、四川、西藏、广西等省区。我国民族地区常将头花蓼用于治疗泌尿系统感染、血尿、湿疹、肾盂肾炎、膀胱炎、尿路结石、风湿痛、跌打损伤、痄鳃、疮疡、腹泻和痢疾等［1－2］。其中黄酮类成分为其主要成分［3－4］。目前文献报道［5－8］测定了不同产地头花蓼中总黄酮、没食子酸、槲皮苷、槲皮素的含量，但同时测定不同产地野生与栽培头花蓼中槲皮素与山奈酚的含量未见报道。本实验采用高效液相色谱法同时测定12批头花蓼中槲皮素与山奈酚的含量，方法灵敏，数据稳定，可为评价不同产地野生与栽培头花蓼质量提供参考。

1 仪器与材料

日本岛津LC－10AT高效液相色谱仪，SPD－10A紫外检测器，浙大智达N2000色谱工作站，SB2200型超声清洗器(上海必能信超声有限公司)。

槲皮素(批号081－90003)、山奈酚(批号0861－200002)对照品均为中国药品生物制品检定所提供。甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯，水为重蒸镏水。头花蓼药材:共12批样品，分别产自贵州、四川、云南、西藏等地，均由贵阳中医学院王祥培副教授教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Alltima C18(5 μm，4.6 mm×250 mm);柱温:室温;流动相为:甲醇－0.4%磷酸(50∶50);流速:0.8 mL·min－1;检测波长:360 nm。理论塔板数按槲皮素、山奈酚计算应不低于4000，在上述色谱条件下，对照品和样品的色谱图见图1。

2.2 线性关系的考察

精密称取槲皮素对照品10.8 mg、山奈酚对照品5.1 mg，各加甲醇溶解定容至100 mL，作为贮备溶液。精密吸取槲皮素贮备液10 mL、山奈酚贮备液5 mL混合，加甲醇定容至50 mL，摇匀，即得混合对照品溶液。精密吸取混合对照品溶液 1、3、6、9、12、15、18 μL，依次进样，以进样量(μg)为横坐标，色谱峰面积为纵坐标进行回归分析，得槲皮素回归方程为:Y=1E+06x－1779.8，r=0.9998，线性范围为 0.0216 μg ～ 0.389 μg。山奈酚为:Y=2E+06x+1758.1，r=0.9993，线性范围 0.0051 μg ～0.0918 μg。

2.3 水解时间的考察

取西藏墨脱产头花蓼粉末0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇－25%盐酸溶液(4∶1)混合液25 mL，称定重量，置水浴中加热回流提取(分别进行0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h 的时间考察)，放冷，称重，用提取液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。按2.1项下色谱条件，分别进样对照品与供试品溶液10 μL测定峰面积，并计算其含量，数据结果见表1。

表1 酸水解时间考察结果(n=3)

2.4 供试品溶液制备

取头花蓼细粉0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇－25%盐酸溶液(4∶1)混合液25 mL，称定重量，置水浴中加热回流1.0 h，放冷，称重，用提取液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5 mL至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.5 精密度试验

吸取对照品溶液10 μL，连续进样5次，记录色谱图，结果槲皮素、山奈酚峰面积的RSD分别为0.96%、1.27%。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在 0、1、2、4、8、12 h 进样，记录色谱图，结果槲皮素、山奈酚峰面积的RSD分别为1.45%、1.26%。表明供试品溶液在0～12 h内稳定性良好。

图1 头花蓼的HPLC色谱图

2.7 重复性试验

取同批药材5份，精密称定，按2.3项下供试品溶液制备方法制备并测定，槲皮素平均含量为0.529%，RSD为1.12%;山奈酚平均含量为0.033%，RSD为1.95%。

2.8 回收率试验

取已知含量头花蓼粉末6份，每份约0.25 g，精密称定，分别添加浓度为 0.108、0.051 mg·mL－1槲皮素、山奈酚对照品溶液10 mL、2 mL，按2.3项下供试品溶液制备方法制备并测定，计算，槲皮素、山奈酚的平均回收率分别为97.37%、97.09%，其RSD分别为1.19%、1.88%，表明该方法回收率较好。结果见表2、表3。

表2 槲皮素回收率试验结果

表3 山奈酚回收率试验结果

2.9 样品含量测定

精密吸取对照品溶液与12批头花蓼药材供试品溶液各10 μL，按上述色谱条件测定，并计算槲皮素、山奈酚的含量。结果见表4。

表4 不同地区头花蓼中槲皮素与山奈酚含量(n=3)

3 讨论

2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》只规定了头花蓼药材中槲皮素含量。本研究同时进行了槲皮素与山奈酚的含量测定，在上述色谱条件下，待测成分与相邻峰达到基线分离，且回收率高，重复性好，为更好地控制头花蓼药材及其制剂的内在质量提供了依据。在检测样品的制备方法上，比较了加热回流0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h，结果1 h 以上，黄酮苷水解基本完全，盐酸的浓度不宜再高，酸性太强对仪器和色谱柱腐蚀作用大。

根据实验的数据结果可知，产于贵州盘县的野生头花蓼中槲皮素、山奈酚含量较高，贵州施秉栽培的头花蓼较四川成都栽培头花蓼的槲皮素、山奈酚含量高，但所收集的12批样品中槲皮素的含量均大于0.1%，均符合2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》的规定，可为头花蓼资源的开发、利用提供数据参考依据。

致谢

西藏墨脱县墨脱镇人民政府王祥森同志提供西藏样品。

［1］ 全国中草药汇编编写组．全国中草药汇编(下册)［M］．北京:人民出版社，1978:282．

［2］ 江苏新医学院编．中药大词典(上册)［M］．上海:上海人民出版社，1977:611．

［3］ 李勇军，骆宏丰，王永林，等．头花蓼黄酮类化学成分的研究［J］．中国药学杂志，2000，35(5):300．

［4］ 万德光．中药品质研究—理论、方法与实践［M］．上海:上海科学技术出版社，2008:333．

［5］ 王祥培，万德光，王祥森，等．不同产地野生与栽培头花蓼中总黄酮的含量分析［J］．时珍国医国药，2006，17(9):1713．

［6］ 杨立勇，王祥培，吴红梅，等．HPLC测定不同产地的头花蓼中槲皮苷的含量［J］．贵阳中医学院学报，2009，31(4):67．

［7］ 王祥培，万德光，王强，等．HPLC测定不同产地的头花蓼中没食子酸的含量［J］．华西药学杂志，2007，22(2):204．

［8］ 吴红梅，贺祝英，王祥森，等．高效液相色谱法测定头花蓼中没食子酸与槲皮苷的含量［J］．时珍国医国药，2009，20(1):18．