应用抗黄曲霉毒单链抗体检测酱油中黄曲酶毒素B1

刘 蓉，杨 炼，孙秀兰，张根义，张 灏，姚卫蓉

（江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122）

应用抗黄曲霉毒单链抗体检测酱油中黄曲酶毒素B1

刘 蓉，杨 炼，孙秀兰，张根义，张 灏，姚卫蓉*

（江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122）

利用本实验室制备的抗黄曲霉毒素B1的单链抗体（ScFv），通过棋盘实验确定了抗原抗体的最适工作浓度，在此之上根据间接竞争酶联免疫法（ELISA）绘制标准曲线，检测酱油中AFB1的含量；通过改变样品的盐浓度及pH来确定其对ELISA检测结果的影响。研究结果表明，利用ScFv检测黄曲霉毒素的最小检测值为0.10ng/mL，平均加标回收率在84%～109%之间，本文建立的ELISA方法在pH5～8，盐浓度小于10%时较稳定。本文建立的利用抗AFB1的ScFv检测黄曲霉毒素含量的方法方便快捷，稳定性较好，并且成本较低，适合于食品中黄曲霉毒素的检测。

单链抗体（ScFv），黄曲霉毒素B1（AFB1），酶联免疫吸附法（ELISA）检测

黄曲霉毒素（aspergillus flavus toxin）是一类结构类似的化合物，其基本结构都有二呋喃环合香豆素，是由黄曲霉、寄生曲霉、模式曲霉（A.nominus）等产毒菌株产生的次生代谢产物［1］，其中黄曲霉毒素 B1（AFB1）是毒性最强的生物素，它与乙肝病毒被认为是肝癌的最主要的两大诱因［2］。因此建立快速便捷的检测方法便成为预防AFB1污染食品的关键。在AFB1的检测中，除去色谱分析之外，免疫学分析方法能实现食品中黄曲霉毒素的高通量、高灵敏度、高特异性分析［3］，然而，传统的免疫学分析法需要的抗体主要来源于小鼠杂交瘤细胞，在筛选单克隆抗体生产杂交瘤细胞株系上，需要做杂交融合，亚克隆筛选，是一个长期复杂的过程，既耗费财力、物力，又浪费时间，且检测所用真菌毒素标准品价格昂贵，所以应用免疫化学法检测黄曲霉毒素的关键是简便快捷地获得抗体。单链抗体是将天然抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL通过一条柔软的连接肽连接成的单链分子，由于抗体的抗原结合位点由重链可变区VH和轻链可变区VL构成，所以这就决定了单链抗体的高特异性的特点［4］，而且在制备单链抗体中能很容易地控制抗体的亲和力和特异性［5］。本文所采用的抗黄曲霉毒素单链抗体是通过噬菌体展示技术筛选目的基因，并在大肠杆菌中表达获得，这就绕开了传统方法制备抗体的繁琐步骤，本文主要研究单链抗体用于ELISA方法，并用以检测酱油中AFB1的含量，同时考察了本研究制备得到的单链抗体的稳定性，主要考察了此方法在不同pH和盐浓度时的稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

蛋白A－辣根过氧化氢酶复合物（Protein AHRP） 购于GE Healthcare公司（上海）；AFB1－BSA复合物 购于江苏微生物研究所；其他药品 均为国药集团上海试剂公司的分析纯级试剂；酱油市售。

酶标仪Multiscan MK3、洗板机wellwash 4 MK 2Thermo公司；恒温振荡仪、移液枪 eppendorf公司；37℃恒温培养箱 上海恒科仪器有限公司；96孔酶标板 costar公司。

1.2 样品前处理

参照GB/T 5009.22－2003［6］。称取10.00g试样于分液漏斗中，用15mL三氯甲烷分次洗涤烧杯，洗液并入分液漏斗，振摇2min，静置分层，放出三氯甲烷层，经用三氯甲烷润湿的无水硫酸钠滤纸过滤，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中重复振摇提取，一并收集，将收集产物在65℃水浴通风挥发干，用2.0mL 20%甲醇－PBS分三次洗涤溶解收集产物，备用。

1.3 ELISA检测步骤

1.3.1 棋盘实验确定抗原抗体最适工作浓度 用pH7.4的碳酸盐缓冲液将AFB1－BSA复合物分别稀释成浓度为1.65、3.30、6.60、13.20、26.40、52.80ng/mL后包被96孔板；将本实验室制备的抗黄曲霉毒素单链抗体稀释成浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156、0.00782、0.00391!g/mL，各取50!L与包被好的抗原进行反应，37℃水浴1h，用含有0.1%Tween 20的PBS（PBST）洗板5次，将残留液体拍干；再向各孔中加入 100!L二抗（将 Protein A用BSA－PBS溶液稀释500倍），37℃水浴1h，用含有0.1%Tween 20的PBS（PBST）洗板5次，将残留液体拍干；加入含H2O2（30%）和TMB（100!g/mL）的醋酸钠缓冲溶液（pH5.5），室温下反应15min后，用50!L 1mol/L的H2SO4终止反应，在酶标仪上读取OD450和OD650，ELISA的信号值为OD450－OD650，当其值大约为1时为抗体与抗原的最适工作浓度。1.3.2 标准曲线的建立 采用间接竞争ELISA方法建立标准曲线，应用1.3.1实验得到的最适抗原抗体工作浓度中得到的抗原浓度包被96孔板后，向其中加入50!L与之对应的最佳浓度的抗体，同时加入0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.10、0.20ng/mL的AFB1标准溶液，以下操作步骤同1.3.1，测定OD450和OD650，计算OD450－OD650，以OD450－OD650的值为纵坐标，以标准浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 利用建立的ELISA方法测定酱油中黄曲霉毒素B1的含量 实验步骤同1.3.2，将标准样品换为经国标处理后的样品，测定 OD450和 OD650并计算其含量。

1.3.4 酱油中黄曲霉毒素B1加标回收率的测定 取酱油样品，向其中分别加入0.50、2.50、5.00、10.00、50.00、100.00ng/mL的标准样品，按国标方法进行提取处理后，用1.3.1的方法进行检测，并根据以下公式计算加标回收率：

加标回收率（%）=（总AFB1质量分数－原样中AFB1质量分数）/添加AFB1质量分数×100%

1.4 pH对ELISA的影响

通过向样品中添加1mol/L HAC和0.1mol/L NaOH溶液，使得样品初提液pH分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，根据已建立的ELISA方法测定其OD450－OD650的值，平行做三次，取平均值绘制曲线。

1.5 盐浓度对ELISA的影响

由于酱油本身含有一定量的氯化钠，所以我们将其进行稀释再向样品中添加氯化钠，使得样品初提液中氯化钠终浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，根据已建立的ELISA方法测定其OD450－OD650的值，平行做三次，取平均值绘制曲线。

2 结果与讨论

2.1 抗原抗体的最适工作浓度

根据棋盘实验找到抗原抗体的最适工作浓度，如图1所示。

图1 抗原抗体反应

由图1可知，当OD450－OD650约为1时抗原的浓度为52.8ng/mL，抗体浓度为0.5!g/mL。

2.2 单链抗体检测的线性范围

利用间接竞争ELISA建立标准曲线，将AFB1标准品加入96孔板中进行反应，分别测定 OD450和OD650，以标准样品的浓度为横坐标，以OD450－OD650的值为纵坐标，绘制标曲（如图2），线性方程为Y=－0.1262X+0.7683。

图2 标准曲线

2.3 单链抗体检测的灵敏度

灵敏度是指测得的AFB1标准溶液的最低浓度OD450－OD650的值与测得0.0ng/mL的OD450－OD650的值之差＞0.1读数，此浓度即为最低检测浓度。

从表1中可以看出，此方法的最低检测浓度为0.10ng/mL。

表1 单链抗体检测的灵敏度

2.4 加标回收率

取一定量的酱油（其AFB1含量为0.5!g/kg，用黄曲霉毒素快速检测试剂盒测得）向其中加入黄曲霉毒素标准溶液，添加量分别为 0.50、2.50 5.00、10.00、50.00、100.00!g/kg，应用ELISA方法检测经处理后样品中黄曲霉毒素的含量，计算加标回收率。

由表2可知，样品三次加标测定后测定的平均回收率在84%～109%之间。

表2 单链抗体用于检测酱油中黄曲霉毒素的加标回收率

2.5 pH对ELISA测定结果的影响

一直以来，研究者普遍认为单链抗体虽然有其不可比拟的制备优势，但是由于其不稳定性，使其在实际食品体系中的应用遇到了很大的障碍。因此，本研究专门考察了其使用稳定性问题。

由图3的曲线图可知，当pH小于5时，ELISA的信号值较低，研究表明此时的酶活性受到了抑制，所以显色反应时颜色较浅，会有假阳性出现；当pH大于8时，ELISA的信号有变大的趋势，这与酶的活性在此时在一定程度上被激活有关，显色反应偏深，会有假阴性结果出现；而在pH5～8时ELISA结果较稳定。

图3 pH对ELISA测定结果的影响

2.6 盐浓度对ELISA测定结果的影响

由图4的曲线可知，当盐浓度在0～10%时，ELISA测定的结果较稳定，而当盐浓度大于10%时，ELISA测定的信号值会有降小的趋势。

3 结论

图4 氯化钠浓度对ELISA测定结果的影响

本文建立的用抗黄曲霉毒素单链抗体检测酱油中黄曲霉毒素含量的方法，当 AFB1含量在0.5～100ng/mL具有良好的线性关系，此方法的最低检测浓度为0.10ng/mL，对样品进行加标回收后所得平均加标回收率为84%～109%；同时我们讨论了在pH2～10及盐浓度0～40%对本文所建立的方法的影响，结果显示在pH小于5时会有假阳性出现，在pH大于8时会有假阴性现象的出现，而在pH5～8时ELISA的信号值较稳定；当盐浓度在10%以上时ELISA的信号会有偏向假阳性的趋势。我们所检测的酱油样品中盐浓度约为2%，经过处理后pH约为7，均在ELISA检测的稳定范围内。综合考察以上各项指标后证明此方法适用于除了酸性食品和腌制食品以外的大部分食品中微量黄曲霉毒素AFB1的检测。传统的应用ELISA检测黄曲霉毒AFB1所需的抗体都是通过免疫动物，然后提取血清而得到，此方法比较繁琐，而且费时费力，所制备的抗体的特异性不如单链抗体的特异性高。我们利用分子生物学技术制备的单链抗体则绕开了以上的繁琐步骤，并且可以大批量地制备性能稳定、特异性强、亲和力高的单链抗体，从而实现大量样品的低成本检测。

［1］吴坤.营养与食品卫生学［M］.第五版.北京：人民工业出版社，2004.

［2］谢光洪，于光，肖成蕊，等.黄曲霉毒素B1免疫检测方法的新进展［J］.中国畜牧兽医，2007，34（7）：145－146.

［3］Paknejad，M，Javad Rasaee M，Mohammadnejad J，et al，Development and characterization of enzyme － linked immunosorbent assay for aflatoxin B1measurement in urine sample using penicillinase as label［J］.Toxicol Sci，2008，33（5）：565－573.

［4］E哈洛和，D莱恩编著，沈关心，龚非力等译.Using Antibodies：A Laboratory Manual［M］.第一版.北京：科学出版社，2002.

［5］Artsaenko O，Peisker M，zur Nieden U，et al.Expression of a single－chain Fv antibody against abscisic acid creates a wilty phenotype in transgenic tobacco［J］.Plant J，1995，8（5）：745－750.

［6］中华人民共和国卫生部.GB/T 5009.22－2003食品中黄曲霉毒素B1的测定［S］.

Application of single－chain antibody against aflatoxin B1detecting the aflatoxin B1in soy sauce

LIU Rong，YANG Lian，SUN Xiu－lan，ZHANG Gen－yi，ZHANG Hao，YAO Wei－rong*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Using the single－chain antibody against aflatoxin B1，the optimal working concentration of antigen and antibody through board experiment was confirmed，and standard curve according to the indirect competitive enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）was drawed，then the content of AFB1in soy sauce by the established method was detected.The impact of salt concentration and pH value on ELISA test results were also studied.The results showed that the detection limit of AFB1was 0.10ng/mL，the average recovery rates were among 84%～109%，it was stable between pH5～8 and salt concentration below 10%.The ELISA method established was stable，convenient in AFB1detecting of food system.

single－chain antibody（ScFv）；aflatoxin B1（AFB1）；enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）detect

TS207

A

1002－0306（2011）01－0281－03

2009－12－01 *通讯联系人

刘蓉（1985－），女，硕士研究生，研究方向：食品安全与质量控制。

“十一五”国家科技支撑计划（2008BAD91B04－2）。