喜树碱含量的测定方法研究

方旭东，陈绍宇

（1.天津渤海职业技术学院，天津300402；2.广西钦州市水利电力勘测设计院，广西钦州535000）

喜树碱含量的测定方法研究

方旭东1，陈绍宇2

（1.天津渤海职业技术学院，天津300402；2.广西钦州市水利电力勘测设计院，广西钦州535000）

本文介绍了喜树碱含量的分析测定方法。样品采用了乙醇超声提取法从喜树叶中提取喜树碱，并用薄层层析法和高效液相色谱法分析测定喜树碱的含量。薄层层析法测定喜树碱的含量使用硅胶G做固定相，v（氯仿）:v（丙酮）=70∶30、v（甲醇）∶v（氯仿）=10∶90做展开剂。高效液相色谱法用v（甲醇）∶v（水）=55∶45做流动相，并且流动相流速为1.0mL/min。在波长为254 nm，温度为25℃下检测。每次进样量为5μL。

喜树碱；高效液相色谱；薄层层析；分析测定方法

目前，农药残留、害虫抗药性以及作物药害等农药产生的副作用，是我们需解决的问题之一。生物农药采用天然产物，对人类、环境和作物是低毒、无毒且残留时间较短的。喜树碱是一种具有生物活性可广泛应用于生物农药的物质，本文利用薄层层析（TLC）法和高效液相色谱（HPLC）法对喜树叶中提取的喜树碱含量进行了分析与测定。该法简便、快捷、准确性高，为将来该领域研究提供了可靠的依据。

1 实验仪器、试剂与材料

1.1 实验仪器

高效液相仪、紫外光检测器、色谱工作站、超声波细胞粉碎机、高速离心机、电子天平。

1.2 实验试剂

甲醇，95%乙醇，无水乙醇，丙酮，氯仿，硅胶G（薄板层析用）。

1.3 植物材料

喜树叶于2010年8月采自钦州市水利局喜树园栽培3年生的喜树幼苗，采集喜树嫩叶（顶芽，顶芽以下1～2片叶）。

用天平称取采得的喜树叶约1000 g，并用自来水将其洗净后置于恒温干燥箱内，调整恒温干燥箱温度至40℃烘干24 h,直到材料发脆，再用60目的DWF-TOOA型粉碎机粉碎，将粉碎好的喜树叶装入密封袋后将其置于4℃冰箱中避光保存，待用。

用电子天平精确称取已经烘干及粉碎过的干燥喜树叶（60目）1.000 g置于25mL容量瓶中，向25mL容量瓶中加入95%乙醇16mL进行超声提取4min后，将其取出并冷却至室温，再用LG10—2.4A高速离心机进行离心处理，最后用乙醇定容，待用[1]。

2 喜树碱含量分析测定方法

2.1 TLC法[2～4]

2.1.1薄层板的制备

用电子天平精确称取6.3 g硅胶G（在硅胶中加入12%～14%作为粘合剂的石膏）将硅胶G与1%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）调和成匀浆。用手动将已调制好的固定相均匀地涂铺在20 cm×5 cm玻璃板上。将铺好的薄板水平放置，室温下晾干，然后将其放入干燥器中，在110℃下活化0.5 h后在干燥器中保存备用。

2.1.2点样

用0.25mm点样毛细管吸取用乙醇超声法提取的提取液，轻轻垂直接触于点样线上（点样线即距离薄层板底边1～2 cm处），反复点样15次，每次点样必须在上一次点样干燥后再点。要求点样直径不超过2～3mm。

2.1.3展开

层析前将展开剂[展开剂用v（氯仿）∶v（丙酮）=70∶30、v（甲醇）∶v（氯仿）=10∶90]倒入层析缸中，让展开剂挥发使层析缸中气体达到饱和状态，将制好的薄层板并点有样品的一端浸在展开剂中，选用直立上行法展开，层析，完毕后取出薄层板并用铅笔标明溶剂前沿。

2.1.4定位

由于喜树碱对多种生物检测试剂均呈负反应，但在紫外光下有明显的蓝色荧光，因此，本试验将薄层板放入暗室中用紫外光来照射，使薄层板上的斑点显现出来从而检测样品中是否有喜树碱存在。

2.1.5定性

TLC法定性主要依据的是组分斑点的比移值Rf=该组分斑点到原点的距离/溶剂前沿至原点的距离。

2.1.6定量

将薄层板上的样斑取下，溶解，再用分光光度法测定。

2.2 HPLC法[5～7]

Waters600高效液相仪，Waters600泵，Waters 486型紫外光检测器；echsphereODS柱（25cm×4.6 mmID，5μm)，流动相为v（甲醇）∶v（水）=55∶45，流速1.0mL·min-1，检测波长254nm，柱温25℃，进样量5μL；按照面积外标法计算。

3 结果与分析

3.1 薄层层析法分析

根据溶剂前沿和喜树碱斑点移动的距离，可以算出喜树碱在氯仿/丙酮展开剂中的比移值Rf（溶质移动距离与流动相移动距离之比）约为0.6；在甲醇/氯仿展开剂中的比移值Rf约为0.80。

3.2 高效液相色谱法分析条件[8～12]

3.2.1检测波长的确定

喜树碱在254nm处有最强吸收，大量研究也以254nm作为喜树碱的检测波长，因此，本试验采用254nm作为紫外检测器的检测波长。

3.2.2流动相的选择

乙腈/水、甲醇/水是高效液相色谱常用的流动相，但考虑到乙腈的毒性较大、成本高，且喜树碱溶于甲醇，所以选择甲醇/水作为流动相。因此，本试验选用流动相，v（甲醇）∶v（水）=55∶45，流速1.0mL·min-1，检测波长254nm，柱温25℃。在此条件下，喜树碱的保留时间适中，峰形良好，出峰时间7.5min左右。

3.2.3喜树碱标准曲线的绘制

用电子天平精确称取喜树碱标准品5.2mg于100mL容量瓶，以100%乙醇为溶剂，超声溶解并定容至刻度，作为对照品溶液。精确吸取对照品溶液0.1mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL、8.0mL置于10mL的容量瓶中，用100%的乙醇溶液分别稀释定容至刻度，摇匀。按照上述色谱条件，分别进样分析，每个样品重复测定3次，分别取峰面积的平均值。标准品HPLC色谱图见图1。以峰面积为纵坐标，喜树碱溶液浓度为横坐标绘制标准曲线图（见图2），进行线性回归，得峰面积（Y）与喜树碱浓度（X）一元线性回归方程：y＝6.0×10-5X－2.321，R2=0.998，线性范围：3.00～44.83mg·L-1。

根据方程可得喜树碱提取率的计算公式如下：

提取率‰=（浓度×体积×10-6/样品质量）×103

图1 喜树碱标准品HPLC色谱图

图2 喜树碱浓度-峰面积标准曲线

3.2.4精密度测定

按照3.2.1和3.2.2所确定的色谱条件，取同一浓度的喜树碱标准溶液连续进样，每次进样5μL。精密度测定当峰面积分别为：729347.9和782139.250时，标准偏差分别为：8425.4和7604.1，相对标准偏差为：1.16%和1.01%，可见标准偏差为7604.1，相对标准偏差约为1.01%时，标准偏差和相对标准偏差均很小，表明试验结果精密度良好。

3.2.5仪器稳定性试验

按照3.2.1和3.2.2所确定的色谱条件，取同一浓度的喜树碱标准溶液，分别于2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h测定其峰面积，每次进样5μL，重复操作三次。

求得标准偏差为152129.90，相对标准偏差为4.76%，见表1，标准偏差和相对标准偏差均较小，表明仪器的稳定性较好，试验数据精确，结果可靠。

表1 仪器稳定性测定结果

3.2.6重现性试验

用电子天平精确称取同一样品5份，每份1.000 g采用乙醇超声法提取：乙醇含量60%，超声提取时间4min。按3.2.1和3.2.2所确定的色谱条件进行喜树碱含量的测定，每个样品重复测量3次。

测得标准偏差为86842.3，相对标准偏差为2.95%（见表2），表明本试验的重现性较好。

表2 重现性试验结果

3.2.7回收率的测定

精确称取同一样品5份，采用乙醇超声法提取，乙醇含量60%，超声提取时间4min。向提取液中分别加入52mg/L的喜树碱标准品溶液10mL，按3.2.1和3.2.2所确定的色谱条件测定喜树碱含量，计算回收率。

回收率(%)=[(加标样后喜树碱含量－样品中喜树碱含量)/加入标样量]×100%

表3 回收率试验结果

可见，平均回收率较高，为96.154，且标准偏差和相对标准偏差均较小，表明以该方法提取喜树碱结果准确可靠。

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10.3969/j.issn.1008-1267.2011.02.019

TQ450.7

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2010-11-04