感染CDV的犬病料N、H、F基因的克隆与序列分析

刘巧荣，包新奇，孙 明，王 芳，乔明明，李 佳，陈曦，秦亚嫚，陈西钊，2

(1.北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，北京 100085;2.中国动物疫病预防控制中心，北京 100085;3.江苏省动物疫病预防控制中心，南京 210036)

感染CDV的犬病料N、H、F基因的克隆与序列分析

刘巧荣1，包新奇3，孙 明1，王 芳1，乔明明1，李 佳1，陈曦1，秦亚嫚1，陈西钊1，2

(1.北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，北京 100085;2.中国动物疫病预防控制中心，北京 100085;3.江苏省动物疫病预防控制中心，南京 210036)

目的 了解病料中犬瘟热病毒(CDV)的变异情况，为犬瘟热的预防与治疗提供理论依据。方法 采用RT-PCR方法对犬病料中CDV的血凝素蛋白(H)、融合蛋白(F)和核衣壳蛋白(N)基因进行扩增，将扩增产物克隆到pGEM-T-easy载体中测序，并进行序列分析。结果 测定一株 CDV的 H、F和 N基因大小分别为1863 bp、1653 bp和2235 bp。同源性分析表明，未发现碱基的插入和缺失。该病毒的 H、F和 N基因分别与国内强毒株BJ080127株的H基因、GN株的F基因和HL株的N基因亲缘关系最近，氨基酸同源性分别为97.3%、97.7%和99.3%。与国外标准野毒株A75-17在核苷酸水平上同源性依次为94.4%、93.8%和97.2%，与疫苗株CDV3在核苷酸水平上同源性分别为88.5%、88.8%和93.9%。系统进化树表明该病毒与国内强毒株在同一谱系。糖基化分析显示，该病毒在F基因3～5位氨基酸处多出1个糖基化位点。结论 本研究从犬病料中成功克隆了犬瘟热病毒血凝素蛋白、融合蛋白和核衣壳蛋白，在F基因中新增了一个糖基化位点，为犬瘟热的遗传变异和流行学研究提供了分子生物学依据。

犬瘟热;血凝素蛋白基因;融合蛋白基因;核衣壳蛋白基因;序列分析S

犬瘟热(canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。该病毒属于副粘病毒科、麻疹病毒属的单股负链RNA病毒。在自然状态下感染犬科、鼬科、浣熊科等多种动物。是养犬业、毛皮兽养殖业的主要传染病。目前，CDV自然感染的动物范围还有不断扩大的趋势，甚至已扩展到偶蹄目猪科及灵长类猕猴属等动物［8］。也有日本学者报道 CDV可感染人［1］，其危害越来越大。因此，本研究对CDV的有效防治具有重要意义。

CDV基因组全长15690 bp，编码6种结构蛋白，分别为核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)、磷蛋白(P)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)、大蛋白(L)。其中F、H和N蛋白是主要的结构蛋白，在机体免疫原性与致病性上发挥着重要作用。本研究从感染CDV的犬病料中克隆出N、H、F基因，与国内外的CDV毒株进行遗传关系比较，旨在分析其在基因水平上发生的遗传变化，为CDV基因序列数据库的丰富和CDV分子流行病学的深入研究提供新的实验数据。

1 材料和方法

1.1 病料和毒株

病料由中国农业大学动物医学院提供。2008年12月，1只3月龄喜乐蒂犬，临床症状有疑似犬瘟热，经过RT-PCR方法和胶体金试剂盒检测为阳性，确诊为犬瘟热。

1.2 载体、菌株和主要试剂

pGEM-T-Easy载体购自于Promega公司，JM109感受态细胞购自于北京全式金生物技术有限公司。EX-Taq酶为TaKaRa公司产品，总RNA提取试剂盒为Bioflux公司产品，胶回收试剂盒为Omega产品。

1.3 引物的设计与合成

根据Genbank上发表的CDV全基因序列，针对N、F、H蛋白的全基因分别设计3对引物，由上海英骏生物技术有限公司合成：

N-P1：5′-GCCTTCTTAARAGCCT-3′

N-P2：5′-TTGTTGGACCTGGGTCCTAAGT-3′

扩增N基因

F-P1：5′-TAATCAAAACTTAGGGTCCAGGA-3′

F-P2：5′-CTACCTGAGCCCTAAGTTTTCT-3′

扩增F基因

H-P1：5′-GCTCAGGTAGTCCARCAATGCT-3′

H-P2：5′-GARATGTGTATCATYATACTGTCA-3′

扩增H基因。

1.4 RNA的提取

将犬瘟热病料的肺组织研磨成匀浆，8 000 r/min 离心 4 min，取上清液 100 μL，按照 Bioflux RNA提取试剂盒操作说明提取病毒总RNA。

1.5 RT-PCR反应

25 μL反应体系中加入DEPC处理的灭菌双蒸水 12.5 μL，5 × PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.5 μL，10 pmol/L 引物 1.5 μL，AMV 反转录酶 0.2 μL(10 U/μL)，RNA 酶抑制剂 0.3 μL(40 U/μL)，TaqDNA 聚合酶 1 μL(5 U/μL)，模板 2 μL。PCR 扩增程序如下，42℃ 1 h，95℃ 3 min;95℃ 45 s，退火温度分别为 44℃ 、46℃ 、50℃ 和 52℃ ，72℃ 90 s，各 10循环;72℃扩增10 min。

1.6 扩增产物的克隆及测序

RT-PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，用胶回收试剂盒回收纯化扩增的目的基因片段，按照pGEM-T easy载体操作手册进行连接，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞。用PCR筛选阳性克隆，将阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司进行测序。

1.7 目的基因序列同源性分析与比较

应用DNAman和DNAStar生物软件分析目的基因序列，并将N、F、H基因序列和推导的氨基酸序列与GenBank上的CDV代表毒株进行同源性分析比较，绘制系统进化树。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR扩增结果

用设计的3对引物对感染肺组织的RNA进行RT-PCR扩增，得到了与N、F、H设计大小一致的目的片段，其片段长度分别约为1 600 bp、2 200 bp和1 800 bp。与预期大小一致(图1)，将病毒命名为CDV-WZ。

2.2 克隆鉴定和测序结果

重组质粒经PCR鉴定显示，成功将3个基因片段克隆到pGEM-T-Easy载体中。阳性质粒经上海英骏生物技术有限公司测序表明，扩增的H、F和N大小分别为1 863 bp、2 235 bp和1 653 bp，未发现碱基的插入和缺失。

2.3 序列同源性分析结果

N基因与Genbank中22株CDV毒株在核苷酸水平上同源性为(CDV3)93.3% ～97.4%(HL)，氨基酸水平上同源性为(CDV3)96.9%～99.3%(HL)。该 CDV-WZ和国外标准野毒株 A75-17和5804核苷酸水平上同源性为97.2%和96.3%，氨基酸水平同源性为98.5%和97.7%;与国外疫苗株Onderstepoort核苷酸水平上同源性为93.9%，氨基酸水平同源性为97.1%，表明该病毒N基因相对保守，变异小。

F基因与其他CDV毒株在核苷酸水平上同源性为(CDV3和 Onderstepoort)88.8% ～98.7%(GN和SC01)，氨基酸水平上同源性为(Onderstepoort)89.0% ～98.8%(TW-TN1)。该 CDV-WZ和野毒株Strain A75-17和Strain 5804核苷酸水平上同源性为93.8%和93.1%，氨基酸水平同源性均为93.5%;与标准疫苗株Onderstepoort核苷酸水平上同源性为88.8%，氨基酸水平同源性为89.0%。另外，由 F基因推导的氨基酸分析表明，F蛋白含有13个半胱氨酸残基，7个潜在的糖基化位点。

H基因与其他CDV毒株在核苷酸水平上同源性为(Onderstepoort和 Vaccine strain Japan)88.1%～97.6%(BJ080127)，氨基酸水平上同源性为(Convac vaccine strain)89.1% ～97.3%(BJ080127)。该CDV-WZ和野毒株Strain A75-17和Strain 5804核苷酸水平上同源性为94.4%和93.8%，氨基酸水平同源性为94.4%和94.1%;与疫苗株Onderstepoort和 Strain CDV3核苷酸水平上同源性为88.1%和88.5%，氨基酸水平同源性为89.7%和90.1%。另外，H蛋白氨基酸分析结果显示，H半胱氨酸残基数目及位置是保守的，没有变化，为13个;糖基化位点为9个。

2.4 系统进化树分析结果

将N、H、F三段基因推断的氨基酸序列和相应代表株进行比对，利用DNAman软件绘制进化树，在系统发生树上可分为强毒和弱毒两大谱系。CDV-WZ位于强毒株谱系，与国内外使用疫苗株亲缘关系很远，可能对CDV免疫保护效果有一定影响。

图2 N基因氨基酸系统进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree of the N gene amino acids

N蛋白与其他CDV毒株的系统进化树显示，CDV-WZ与2007年黑龙江从狐狸分离的 HL强毒株在一个分支。F蛋白与其他毒株的系统进化树表明(图3)，CDV-WZ和黑龙江2007年从浣熊分离的强毒株GN强毒株归为一组。而从H基因推导的氨基酸系统发生树上看，CDV-WZ和北京新分离的BJ080127强毒株在同一分支，与辽宁2007年从浣熊分离的LN(07)1、山东2008年从狐狸分离的SD(08)1以及GN毒株在同一大的分组;同时与近几年分离的 HeB(07)1、JL(08)1、HLJ(08)2强毒株也很接近。

从系统进化树可以看出，最新分离的毒株通常在进化树的末端，但也有例外的，如山东2008年从狐狸分离的HT-P毒株就在进化树的较前部(图4)。这基本说明CDV各毒株在不断地发生新的变异。从地域来看，国外和国内毒株还是存在较大差异，这可能与环境、原始毒株以及不同的选择免疫压力有关。从国内来看，南北差异不大，如新疆2003年分离的 TN、浙江2008年分离的 HZ026、湖北2006年分离的 BS0610、HLJ(08)2、JL(08)1以及 HeB(07)1又在同一大的分支上(图3和图4)。此外，从不同种动物分离的毒株间的差异也在不断缩小。这可能与近年来区域间的频繁交流、不同动物的混养等有较大的关系。

图3 F基因氨基酸系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree of the F gene amino acids

图4 H基因氨基酸系统进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree of the H gene amino acids

3 讨论

N蛋白是保守性最强的免疫原性蛋白，含有B细胞和T细胞表位，在诊断和细胞免疫方面发挥着重要作用，对病毒装配、转录和复制过程起调控作用。F蛋白介导囊膜和细胞膜融合，决定病毒在宿主体内扩散的能力，尽管该基因相对保守，但其微小的改变会对CDV毒力强弱产生影响。H蛋白位于病毒粒子的表面，是诱导机体产生中和抗体的主要抗原之一，同时，H蛋白决定着病毒感染宿主的特异性，并协助F蛋白使 CDV进入宿主细胞［6，7］。故H蛋白基因成为国内外学者研究CDV遗传变异规律的首选基因［14，15］。

本研究病毒的F和H基因分别与Strain BS0610、Strain GN、Strain SC01、Strain TW-TN1 和BJ080127、Hamamatsu、HB062、TN 有较高的同源性，在系统分类上与野毒株较近，属于强毒株。用本研究病料接种45日龄健康比格犬，出现了明显的双相热，并出现了100%的死亡率，充分验证了CDV-WZ为强毒。F、H基因及其推导的氨基酸和国内外疫苗株的同源性均较低，有可能对犬瘟热免疫保护有一定影响。这与王君玮等对狐、貉和水貂源共5株CDV野毒和疫苗株部分H基因氨基酸序列分析的结果相类似［2］。近几年日本免疫犬暴发了犬瘟热，经研究表明，可能与H蛋白抗原性变化有关［9］。

H蛋白属于典型的II型糖蛋白，在病毒的吸附和侵入宿主细胞过程中起重要作用。文献报道，所有CDV野毒株H蛋白均存在8～9个潜在的N-联糖基化位点，而疫苗株为4个(Onderstepoort株)或7个(Convac株)，H蛋白N-联糖基化位点的差异可能影响病毒的抗原性［8，9］。另有研究证实，在麻疹病毒属所有结构蛋白中，H蛋白基因变异最大［9，11-13］，抗原变化最大［15］。在免疫压力作用下，CDV抗原表位可能发生漂移，较大的H蛋白极易发生变异，从而引起 CDV 毒力的变化［16，17］。H 蛋白作为诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原，其抗原性的改变很可能导致CDV野毒逃避机体的免疫监视，共同特征之一是造成CDV在不同种动物之间，不同地区以不同毒株的形式大面积爆发［18］。

在CDV所有结构蛋白中，N蛋白是保守性最强的免疫原性蛋白。N蛋白在337～358位或者1～80位的氨基酸存在B细胞表位，其中1～80位氨基酸是N蛋白转运到细胞核所必需的［1］。281～289位即Y P A L G L H E F连续9个氨基酸高度保守，是T细胞表位，在细胞免疫中发挥重要的功能［10］。Pascal Cherpillod等［19］证实CDV N蛋白可以刺激机体产生强烈的抗体反应，当H和F蛋白的特异性抗体低于检测水平时，N蛋白的特异性抗体仍可以检测到，这也揭示出N蛋白在CDV感染的检测中具有重要的意义。本研究克隆了整个开放阅读框，核苷酸和推导的氨基酸同源性分析显示，N蛋白的保守性较H和F蛋白高，进一步验证了N蛋白较高的保守性。

F蛋白是典型的 I型糖蛋白，在病毒侵入机体和刺激机体产生免疫保护性反应中发挥着重要作用，其诱导的免疫反应能阻止病毒感染，抑制犬瘟热临床症状产生。F蛋白的 T细胞表位(288～302aa)和B细胞表位(404～414aa)构成嵌合多肽，能诱导保护性免疫反应［3，4］。研究发现该蛋白基因相对比较保守［5］，在诊断上亦具有一定的价值。在CDV-WZ的F蛋白中，对蛋白的二级结构起着重要作用的13个Cys残基位置与其它毒株一致，对蛋白的裂解、稳定性和生物学活性都很重要的4个潜在的N-联糖基化位点也完全保守。与其它大部分CDV毒株(糖基化位点4～6个)相比，在 CDV-WZ氨基酸的3～5位置多出了1个糖基化位点。这对F抗原性的影响还有待进一步的研究。

［1 ］ Yoshida E，Iwatsuki K，Miyashita N，et al.Molecular analysis of the nucleocapsid protein of recent isolates of canine distemper virus in Japan ［J］.Vet Microbiol，1998，59(2-3)：237-244.

［2］ 王君玮，姜平，王志亮，等.貂、狐、貉源犬瘟热病毒分离株 H和N基因的遗传多样性分析［J］.南京农业大学学报，2007，30(4)：108-113

［3］ Obeid OE，Partidos CD，Howard CR，et al.Protection against morbillivirus-induced encephalitis by immunization with a rationally designed synthetic peptide vaccine containing B-and T-cell epitopes from the fusion protein of meales virus［J］.J Gen Virol，1995，69(3)：1420-1428.

［4 ］ Barret T，Clorke DK，Evons SA，et al.The nucleotide sequence of gene encoding the F protein ofcanine distempervirus：a comparison of the deduced amino acid sequence with other paramyxovirus［J］.Virus Res，1987，8：373-386.

［5］ Merz DC，Seheid A，Choppin PW，et al.Importance of antibodies to the fusion glycoprotein of paramyxoviruses in the prevention of spread of infection［J］.J Exp Med，1980，15：275-288.

［6］ Kingsbury DW.Paramyxoviridae and their replication.In：B.N.Fields(Ed.)，Field's Virology［M］.Raven Press，New York(1990)，945-962.

［7］ Wild TF.Mode of entry of morbilliviruses［J］.Vet Microbiol.1995，44：267-270.

［8］ Boit G，Jensen TD，Gottschalck E，et al.Genetic diversity of the attachment(H) protein gene of current isolates of canine distemper virus［J］.Gen Virol，1997，78：367-372.

［9］ Iwatsuki K，MiyashitaN，YoshidaE，etal. Molecularand phylogenetic analyses of the haemagglutinin(H)proteins of field isolates of canine distemper virus from naturally infected dogs［J］.Gen Virol，1997，78(2)：373-380.

［10］ Beauverger P，Buckland R，Wild TF.Measles virus antigens induce both type-specific and canine distemper virus crossreactive cytotoxic T lymphocyte in epitope［J］.J Gen Virol，1993，74：2357-2363.

［11］ Blixenkrone-Möller M，Svansson V，Appel M，et al.Antigenic relationships between field isolates of morbillivimses from different carnivores［J］.Arch Virol，1992，123：279-294.

［12］ Blixenkrone-Möller M，Svansson V，Have P，et al.Studies on manifestations of canine distemper virus infection in an urban dog population［J］.Vet Microbiol，1993，37：163-173.

［13］ Iwatsuki K，Tokiyoshi S，Hirayama N，et al.Antigenic difference in the H proteins of canine distemper viruses［J］.Vet Microbiol，2000，71：281-286.

［14］ Haas L，Martens W，Greiser-Wilke I，et al.Analysis of the haemagglutinin gene of current wild-type canine distemper virus isolates from Germany.Virus Res，1997，48：165-171.

［15］ Mochizuki M，Hasimoto M，Hagiwara S，et al.Genotypes of canine distemper virus determined by analysis of the hemagglutinin genes of recent isolates from dogs in Japan［J］.Clinical Microbiol，1999，37(9)：2936-2942.

［16］ 许莎琼，朱建国，傅志强，等.犬瘟热病毒当前研究进展［J］.中国畜牧兽医学报，2006，1：5-7.

［17］ 莫小见，郭爱珍，陆承平.犬瘟热病毒南京株 H蛋白的克隆与表达［J］. 中国病毒学，2004，19(5)：487-489.

［18］ 赵建军，闫喜军，吴威.犬瘟热病毒基因变异及其细胞受体研究进展［J］. 微生物学报，2008，48(7)：986-991.

［19］ Cherpillod P，Tipold A，Griot-Wenk M，et al.DNA vaccine encoding nucleocapsid and surface proteinsoftype canine distemper virus protects its natural host against distemper［J］.Vaccine，2000，(18)：2927-2936.

Cloning and Sequence Analysis of Canine Distemper Virus N，F and H Genes from the Samples Infected with CDV

LIU Qiao-rong1，BAO Xin-qi3，SUN Ming1，Wang Fang1，QIAO Ming-ming1，LI Jia1，CHEN Xi1，QIN Ya-man1，CHEN Xi-zhao1，2
(1.Beijing ANHEAL Laboratories Co.Ltd，Beijing 100085，China;2.China Animal Disease Control Center，Beijing 100085;3.Jiangsu Animal Disease Control Center，Nanjing 210036，China)

Objective The aim of this study was to identify the variations of canine distemper viruses(CDV)obtained from clinical samples，and provide a theoretical basis for the prevention and control of CDV infection.Methods The segments of hemagglutinin protein(H)gene，fusion protein(F)gene and nucleocapsid protein(N)gene were amplified by RT-PCR.The amplicons were cloned into pGEM-T-easy vector and the recombination clones were sequenced.Subsequently，the nucleotide and amino acid sequences were analyzed.Results The nucleotide lengths of H，F and N genes for the virus were 1863 bp，1653 bp and 2234 bp，respectively.Sequence analysis did not present any nucleotide insertion or deletion.The three sequences determined in this study showed the high amino acid identities corresponding with three Chinese highly pathogenic CDV isolates BJ080127(H gene)，GN(F gene)and HL(N gene)，which were 97.3% ，97.7%and 99.3% ，respectively.Meanwhile，each of them displayed the nucleotide identity of 94.4% ，93.8%and 97.2% ，when compared with the CDV prototypic strain A75-17.In addition，comparing with the CDV vaccine strain CDV3，they displayed the nucleotide similarities of 88.5% ，88.8%and 93.9% ，respectively.The glycosylation sites analyses revealed a glycosylation site aimed at the 3～5 amino acids of F gene.The phylogenetic tree displayed that the virus had the closest relationship with the highly pathogenic CDV isolates identified in China.Conclusion In this study，we cloned the H，F and N genes of a CDV determined in canine samples and identified that the virus is a highly pathogenic CDV，which contains a novel glycosylation site in F gene.This study provides evidence in studies on the molecular mutation epidemiology of CDV infection.

Canine distemper virus;Hemagglutinin protein gene;Fusion protein gene;Nucleocapsid protein gene;Sequence analysis

R33

A

1671-7856(2011)04-0037-05

2010-10-12

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.009

刘巧荣(1979-)女，硕士。主要研究方向：动物疫病诊断。

陈西钊，博士，研究员，Email：chenxizhao@anheal.com。