结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表达载体的构建

袁 伟，刘江宁，向志光，林树柱，张丽芳，秦 川

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京 100021)

结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表达载体的构建

袁 伟，刘江宁，向志光，林树柱，张丽芳，秦 川

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京 100021)

目的 构建结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因，并对其在体外真核细胞中进行表达。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增 Ag85B、Esat6、HspX基因，插入到 pUC19-T载体，序列测定正确后，将融合基因再次克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。重组质粒经酶切鉴定并测序正确后，用MegaTran 1.0转染293T细胞，并用Western-Blot检测目的蛋白的表达。结果 Western-blot检测到分子量大小约65 kDa的目的蛋白。结论 成功地构建了结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表达载体，且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。

结核分枝杆菌;Ag85B;Esat6;HspX

结核病是由结核分枝杆菌引起的一种传染性疾病。据世界卫生组织报道，目前全球有近1/3的人感染了结核杆菌。随着多重耐药菌、极度耐药株的出现，艾滋病与结核共感染人群的增加使得活动性结核病人日益增多［1］。卡介苗(BCG)是法国科学家Camille Guerin和Charles Calmette在上个世纪第一个10年中开发出来的，1921年开始应用于人类，迄今已使用了80多年。在世界卫生组织免疫接种扩大方案中，卡介苗作为目前唯一的结核病疫苗正在广泛使用。接种后可预防儿童发生结核病，但卡介苗对成人肺结核的保护效率差别很大(0-80%)。抗原85复合体是一组具有较强细胞免疫及体液免疫活性的分枝杆菌分泌性蛋白。该复合体由 Ag85a、Ag85b、Ag85c构成。抗原分析表明 3者中以 Ag85a和 Ag85b最具有免疫原性。EAST6(6kD early secretory antigenic target)即6KD早期分泌性抗原性蛋白，是从结核杆菌短期培养滤液中纯化分离出的一种低分子量的分泌性蛋白，具有较强的细胞免疫活性。HspX为结核菌休眠期调控子(DosR Regulon)中的基因 hspx(Rv2301)编码的16kD蛋白，属于小分子热休克蛋白家族。有研究表明HspX在结核分枝杆菌感染后短时间内减缓其在体内生长速度方面可能起到某种关键作用［2］。休眠状态结核杆菌在人体内是普遍存在的。感染机体的结核杆菌可能有处于休眠状态的。结核杆菌被巨噬细胞吞噬后，受到天然免疫物质NO等的攻击，可能转入休眠状态。同时，处在结核结节低氧环境中的细菌，也大多转入休眠状态。卡介苗(BCG)免疫机体后，由于休眠期抗原表达量低，不能针对休眠期细菌产生免疫反应，导致对休眠状态结核杆菌没有免疫保护。然而在与结核病患者密切接触的健康人群中，发现对休眠期抗原存在很强的免疫应答［3］。由于HspX是结核分枝杆菌潜伏感染期机体免疫反应的重要靶抗原，所以含有该抗原或抗原基因的疫苗可能会增强潜伏感染人群体内的细胞免疫，进而清除结核菌。本研究构建了Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表达载体，为下一步结核新型疫苗的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒和细胞系

E.coli DH5a感受态细胞购自北京全式金生物技术公司。MTB H37Rv株由中国生物制品检定所惠赠。pUC19-T载体、真核表达载体 pcDNA3.1(-)由本室保存。293T细胞系冻存于本室。

1.2 试剂

Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamH I、Hind III及DNA分子量marker均购自Takara大连公司。质粒小量抽提试剂盒购于Promega公司。胶回收试剂盒购自Qiagen公司。脂质体MegaTran 1.0购自OriGene Technologies公司。胎牛血清及DMEM培养基为美国Gibco公司产品。Ag85B、Esat6抗体为美国Abcam公司产品，HspX抗体购自美国Santa Cruz公司。HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体及羊抗兔IgG抗体购自北京中杉金桥生物公司。

1.3 MTB基因组DNA提取

将生长3～4周L-J培养的结核杆菌刮下，90℃水浴15 min灭活细菌。4 000 r/min离心10 min。弃上清液，1×TE溶液重悬细菌。加入溶菌酶37℃振荡2 h，再加入蛋白酶 K，37℃振荡过夜。加入等体积Tris饱和酚，8 000 r/min离心10 min。取上清液，加入等体积酚：氯仿：异戊醇，再次离心后，无水乙醇沉淀，溶于100 μL TE中。

1.4 融合基因的扩增及序列测定

根据已公布的 Ag85B、Esat6和 HspX基因的序列，设计引物，引物序列见表1。PCR反应体系为：

10 × buffer 2 μL，dNTP 2 μL，DNA 模板 1 μL，P1、P2 引物各 1 μL，高保真酶 0.2 μL，加水至 20 μL。PCR 反应条件：95℃ 变性 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 3 min，共 30 个循环，再 72℃延伸 5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，回收DNA条带，按说明用凝胶DNA纯化试剂盒纯化扩增产物。取纯化的 PCR产物与 pUC19-T载体，在T4 DNA连接酶催化下，于室温连接2 h，转化至E.coli DH5a感受态细胞，涂布于LB平板(含氨苄青霉素100 mg/L)。用菌落PCR法挑选阳性克隆，接种于5 mL含氨苄青霉素的 LB中，37℃振荡培养过夜，小量提取质粒DNA，经酶切鉴定后，进行序列测定，由Invitrogen公司完成。

1.5 重组质粒的构建及鉴定

用BamH I和 Hind III双酶切 pUC19-Ag85BEsat6-HspX质粒，获得 Ag85B-Esat6-HspX融合基因，凝胶回收目的基因片段后再次克隆至同样双酶切的真核表达载体 pcDNA3.1(-)，转化至 DH5a感受态细胞。用菌落PCR法挑选阳性克隆，接种于5 mL含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养液，37℃振荡培养过夜。提取质粒 DNA，用 BamHI和 HindIII双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒，并再次送Invitrogen公司进行序列测定。

表1 H37Rv基因组中扩增目的基因所需引物Tab.1 Primers for amplification of the genes from M.tuberculosis H37Rv

图1 PCR扩增融合基因Fig.1 Amplification of fusion gene by PCR

图2 双酶切鉴定重组质粒Fig.2 Identification of recombinant plasmid by restriction enzyme digestion

1.6 细胞转染

将2×105个/孔细胞接种于6孔板，细胞数量达孔底60%～70%时进行转染。转染前用不含抗生素的DMEM培养液洗2次。取1 μg/μL的重组质粒6 μL和2 μL MegaTran 1.0脂质体混匀后缓慢加入到细胞中，继续培养48 h后收集细胞进行Western blot检测。同时设不加任何处理的293T细胞作阴性对照。

1.7 Western blot检测融合基因的表达

收集转染后细胞，PBS洗涤后，加入裂解缓冲液充分裂解，离心后收集上清液，行免疫印迹分析。

一抗分别为抗Ag85B的多克隆抗体、抗 Esat6的单克隆抗体和抗HspX的单克隆抗体。二抗为HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体及羊抗兔IgG抗体(稀释比例为 1∶10 000)。

2 结果

2.1 融合基因的扩增

以MTB H37Rv基因组为模版，用合成的融合基因引物PCR扩增，经30个循环，可扩增出与预计长度相等的1 800 bp左右片段(图1)。将目的基因片段回收后再克隆入 pUC19-T载体，酶切鉴定后测序。测序结果证明所扩增的融合基因序列完全正确(资料未显示)。

2.2 重组质粒的构建及鉴定

将测序正确的pUC19-Ag85B-Esat6-HspX质粒经双酶切后与同样处理的 pcDNA3.1(-)连接转化，菌落PCR挑选阳性克隆，用BamHI和HindIII双酶切后，可切出约1800 bp的片段(图2)，再次测序结果证明克隆正确。阳性克隆命名为pcDNAAg85B-Esat6-HspX。

2.3 Western blot检测融合蛋白表达

分别用抗Ag85B抗体、抗Esat6抗体和抗HspX的抗体与SDS-PAGE凝胶电泳后转移的PVDF膜杂交。结果显示：每个抗体均能检测到大小为65 kDa的蛋白，与预期的蛋白大小一致。证明重组质粒能够在真核细胞中稳定表达(图3)。

图3 Western blot检测融合蛋白的表达WT： wild type group，Mo： empty vector group，FU：Fusion protein groupFig.3 The expression of fusion protein by determined by Western blot

3 讨论

DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的一种新型疫苗。自1996年WHO将结核病DNA疫苗研究列为资助项目以来，其发展十分迅速。该疫苗有如下特点：①细胞内生成的抗原易于被MHCI类和II类分子呈递，可激活细胞毒性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞;②在一段时间里持续表达抗原，具有较强的免疫刺激作用;③操作技术简单。结核DNA疫苗能够很好地激发细胞免疫反应，是理想的结核疫苗形式。一些结核保护性抗原的DNA疫苗如Mtb8.4，Ag85B，ESAT6，Hsp65 和 MPT83 等都能诱导小鼠细胞介导的免疫反应。

范雄林等［4］在小鼠模型上将不同结核保护性抗原的DNA疫苗进行了免疫原性及保护效力的比较，发现Ag85B是比较理想的候选抗原。王清民等［5］对融合泛素的 Esat6核酸疫苗进行了研究，发现该DNA疫苗不仅增强了细胞免疫反应，而且对结核感染提供了很好保护。此外，细胞因子不仅可作为免疫佐剂增强DNA疫苗的免疫原性还可以诱导DNA疫苗刺激机体后所产生免疫应答的方向。将细胞因子和抗原嵌合表达或共同导入体内表达被证实有增强结核疫苗保护力的作用。师长宏等［6］构建的人 IL-2与 Hsp65融合基因的 DNA疫苗，对感染结核的小鼠有很好的预防保护效果。

结核病疫苗目标人群大体分为三类：正常人群(未感染结核分枝杆菌)、潜伏感染人群(已感染结核杆菌但未发病)、免疫低下人群(由于各种原因免疫功能低下)。随着人们对潜伏感染的认识，休眠期结核杆菌开始受到重视。休眠期结核杆菌为了适应缺氧等恶劣生存环境部分基因表达上调。Leyten EM等［7］用 25种 DosR Regulon编码的休眠期抗原进行实验，发现与结核病人相比，健康的结核菌素实验阳性者外周血单个核细胞(PBMC)能识别更多的休眠期抗原，并产生更强烈的IFN-γ反应。HspX抗原可以被致敏的T细胞识别，刺激T细胞分泌IFN-γ，具有细胞免疫和体液免疫原性。在健康的与肺结核患者密切接触的家人(80%)和医务工作者(90%)中，HspX具有明显的T细胞刺激活性，比例明显高于普通人群(50%)，提示HspX抗原具有免疫保护作用。

本研究将休眠期抗原与对数生长期抗原联合使用，成功构建了能够在真核细胞表达融合蛋白的重组质粒，为进一步研究该融合蛋白的免疫原性及保护作用奠定了基础。

［1］ Gandhi NR，Shah NS，Andrews JR，et al.HIV coinfection in multidrug-and extensively drug-resistant tuberculosis results in high early mortality［J］.Am J Respir Crit Care Med，2010，181：80-86.

［2］ Hu Y，Movahcdzadeh F，Stoker NG，et al.Deletion of the Mycobacterium tuberculosis alpha-crystallin-like HspX gene causes increased bacterial growth in vivo［J］.Infec Immun，2006，74(2)：861-868.

［3］ Vekemans J，Ota MO，Sillah J，et a1.Immune responses to mycobacterial antigens in the Gambian population：implications for vaccines and immunodiagnostic test design［J］.Infect Immun，2004，72(1)：381-388.

［4］ Fan XG，GaoQ，FuRL.Differentialimmunogenicityand protective efficacy ofDNA vaccines expressing proteins of Mycobacterium tuberculosis in a mouse model［J］.Microbiol Res，2009，164：374-382.

［5］ Wang QM，Kang L，Wang XH.Improved cellular response elicited by a ubiquitin-fused Esat6 DNA vaccine against Mycobacterium tuberculosis［J］.Microbiol Immunol，2009，53：384-390.

［6］ Shi CH，Zhang H，Wang LM，et al.Therapeutic efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding heat shock protein 65 of Mycobacterium tuberculosis and the human interleukin2 fusion gene［J］.Tuberculosis，2009，89： 54-61.

［7］ Leyten EM.Human T-cellresponsesto25 novelantigens encoded by genes of the dormancy regulon of Mycobacterium tuberculosis［J］.Micorbes Infect，2006，8：2052-2060.

Construction of an Eukaryotic Expression Vector Encoding the Ag85B-Esat6-HspX Fusion Protein against Mycobacterium Tuberculosis

YUAN Wei，LIU Jiang-ning，XIANG Zhi-guang，ZHANG Li-fang，QIN Chuan
(Institute of Laboratory Animal Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

Objective To construct fused gene Ag85B-Esat6-HspX of Mycobacterium tuberculosis and investigate its expression in eukaryotic cells in vitro.Methods The gene encoding Ag85B，ESAT6 and HspX protein was amplified by PCR from genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain，and was inserted into cloning vector pUC19-T.After the sequence was confirmed，the fused gene was subcloned to eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-).After identified by restriction enzymec digestion and verified by DNA sequencing again，the recombinant plasmid pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX was transfected into 293T cells with MegaTran 1.0.Western blot was used to detect the expression of goal protein.Result A 65 kDa protein was detected with specific antibodies.Conclusion The eukaryotic expression vector pcDNAAg85B-Esat6-HspX has been constructed successfully and the fusion protein could be expressed specifically in 293T cells.

Mycobacterium tuberculosis;Ag85B;Esat6;HspX

R521;R33

A

1671-7856(2011)04-0052-04

2010-09-28

10.3969/j.issn.1671-7856.2011.04.012

十一五重大专项支持(2009ZX1004-402)。

袁伟(1977-)，博士研究生。Email：docyw@sohu.com。

秦川，教授，博士生导师。Email：chuanqin@vip.sina.com。