响应面法优化块菌多糖提取工艺条件的研究

张世奇，阚建全，*

(1.西南大学食品科学学院，重庆400715; 2.重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆400715)

响应面法优化块菌多糖提取工艺条件的研究

张世奇1，2，阚建全1，2，*

(1.西南大学食品科学学院，重庆400715; 2.重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆400715)

为确定块菌多糖超声中性水提取的最佳工艺条件，以块菌多糖提取率为考察指标，在单因素实验的基础上，采用响应面法对主要提取工艺参数进行了优化，并得到了回归模型。研究结果表明:块菌多糖超声中性水提取的最优工艺条件参数为超声功率为105W，提取时间为40min，料液比为1∶25，提取温度为75℃。在此条件下，块菌多糖的提取率达到3.48%。实验证明模型拟合程度良好，误差较小，模型的选择合适。

块菌，多糖，响应面法，超声提取工艺条件

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

块菌(Truffle) 产自四川省会东县，真空包装，冻藏备用;无水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、硫酸 成都市科龙化工厂，分析纯。

FZ102型微型植物试样粉碎机 北京市光明医疗仪器厂;KUBOTA3740型冷冻离心机 KUBOTA Corporation;RE52-98型旋转蒸发仪 亚荣生化仪器厂;超声萃取装置KQ3200DB 江苏昆山市超声仪器有限公司;UV-2000紫外分光光度计 上海尼柯仪器有限公司;HH-W420数显三用恒温水箱 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 块菌多糖制备的基本工艺流程［5-6］块菌原料→破碎(过100目)→70%(150W)超声浸提→离心分离(4500r/min，15min)→减压浓缩→乙醇沉淀→离心分离(4500r/min，15min)→溶剂干燥→粗多糖

1.2.2 单因素影响实验［8］以中性水为提取剂，采用超声处理，选用影响提取率的4个因素，即超声时间、料液比、超声功率(其工作频率为40kHz，超声电功率为150W)、提取温度。按照1.2.1的制备方法提取块菌多糖，并计算提取率。

1.2.3 响应曲面法实验设计 综合单因素影响的实验结果，采用Box-Behnken实验设计方案选取超声功率(W)、超声时间(min)、料液比(mL/g)、提取温度(℃)4个影响因素，采用四因素三水平的响应面分析方法，分别用X1、X2、X3、X4来表示，并以+1、0、-1分别代表变量的水平，按方程xi=(Xi-X0)/ΔX对自变量进行编码。其中xi为变量的编码值。Xi为变量的真实值，ΔX为变量的变化步长，块菌多糖的提取率Y为响应值(表1)。

表1 响应面分析因素与水平

1.2.4 块菌多糖的提取率测定 粗多糖量的测定方法:苯酚-硫酸法［9］。以吸光值为纵坐标，葡萄糖溶液浓度为横坐标，绘制工作曲线(图1)，并求得标准曲线回归方程，其相关系数R2=0.9994，表明在所实验的0.1～1.0mg/100mL浓度范围内呈良好的线性关系。

图1 葡萄糖标准曲线

精密吸取多糖溶液1mL置于10mL的干燥比色管中，加入5%的苯酚1mL，混匀，再匀速滴加5mL浓硫酸，即刻摇匀。于沸水浴中加热5min，冷却至室温后，在490nm处比色测吸光值。

粗多糖的提取率(%)=粗多糖的量/原料质量×100%

2 结果与分析

2.1 单因素对块菌多糖提取率的影响

2.1.1 超声功率对块菌多糖提取率的影响 采用中性纯水，料液比为1∶10，超声时间为30min，提取温度为60℃。考察超声功率对多糖提取率的影响(图2)。由图2可知，块菌多糖的提取率在超声功率较低时随着超声功率的上升而增加，在超声功率为105W时达到最大值，之后随着超声功率的增加，提取率下降，并在超声功率为135W的时候，下降趋势变缓。

图2 超声功率对块菌多糖提取率的影响

2.1.2 超声时间对块菌多糖提取率的影响 采用中性纯水，料液比为1∶10，超声功率为105W，提取温度为60℃。考察超声时间对块菌多糖提取率的影响(图3)。

图3 超声时间对块菌多糖提取率的影响

由图3可知，块菌多糖的提取率随着超声时间的增加而呈现出先升高后降低的趋势，这是由于随着超声时间的延长，细胞的破碎度越来越大，多糖就更加容易溶出。而当超声时间超过40min时，细胞内的大量的不溶物质和粘液质等混入提取液中，使溶液中的杂质增多，粘度变稠，从而影响了多糖的溶出。另外时间过长，会造成多糖的分解，也是后期多糖提取率下降的原因［10-11］。

2.1.3 料液比对块菌多糖提取率的影响 采用中性纯水，超声时间为40min，超声功率为105W，提取温度为60℃。考察料液比对块菌多糖提取率的影响(图4)。

图4 料液比对块菌多糖提取率的影响

由图4可知，随着料液比的增大，块菌多糖的溶出呈逐渐上升的趋势，在1∶25时达到最大值，而后慢慢趋于稳定。这是由于料液比较少时，不利于多糖的溶出。

2.1.4 提取温度对提取率的影响 采用中性纯水，超声时间为40min，超声功率为105W，料液比为1∶25。考察提取温度对块菌多糖提取率的影响(图5)。

由图5可知，随着提取温度的上升，块菌多糖的提取率开始是缓慢上升，直至温度达到65～75℃时，提取率迅速上升，而后又逐渐变缓甚至慢慢下降。这主要是由于温度从室温上升到65℃时，块菌多糖在提取剂中的溶解度基本保持不变，所以在料液比一定的情况下，提取率没有变化。但当温度达到80℃的时候，提取率有所下降，这可能是高温下部分多糖被水解的结果。

表3 二次响应模型方差分析

图5 提取温度对提取率的影响

2.2 响应面结果与分析

2.2.1 实验结果 实验采用Box-Behnken设计［12-15］，用自变量X1、X2、X3、X4来表示超声功率(W)、超声时间(min)、料液比(g/mL)、提取温度(℃)4个影响因素。以块菌多糖的提取率为响应值(Y)，其设计表与结果见表2。

利用Design Expert 7.0软件对实验结果进行响应面分析，得出回归模型参数方差分析见表3。

由方差分析可知，模型的P值显著。失拟项P= 1.26(＞0.05)，差异不显著，未知因素对实验结果干扰小，说明残差均由随机误差引起。R2=0.993，说明模型拟合程度良好，实验误差小，该模型能够反映响应值的变化。其二次方程为:

对表3的结果作响应面分析，见图6～图11，其中各图表示X1、X2、X3、X4中任意两个变量取零水平时，其余两个变量对多糖提取率的交互影响。

表2 响应面分析方案及实验结果

从图8可以看出，在一定的范围内，块菌多糖的提取率随着超声功率和提取温度的增加而升高，两者交互作用为极显著。由图10同样可以看出，块菌多糖的提取率也随着超声时间和提取温度的增加而逐渐提高，两者交互为极显著。根据动力学原理，超声温度的升高，使得多糖分子的运动加剧，时间的延长有利于多糖的充分扩散析出，随着超声功率的升高，使得多糖分子解附和扩散的运动速率不断加快，从而使提取率升高。由图9看出，随着超声时间和料液比的不断升高，多糖的提取率也随之逐渐提高，两者交互为显著。从图6、图7、图11可得其它几种交互作用对多糖的提取率影响较小，两者交互作用均为不显著。

图6 超声功率与提取时间及其相互作用对块菌多糖提取率影响的响应面

图7 超声功率与料液比及其相互作用对块菌多糖提取率影响的响应面

图8 超声功率与温度及其相互作用对块菌多糖提取率影响的响应面

图9 超声时间与料液比及其相互作用对块菌多糖提取率影响的响应面

图10 超声时间与温度及其相互作用对块菌多糖提取率影响的响应面

图11 温度与料液比及其相互作用对块菌多糖提取率影响的响应面

2.2.2 验证实验 利用Design Expert 7.0软件进行工艺参数的优化组合［16］，所得产品提取率最大值对应的相关参数、预测值、验证结果见表4。

表4 优化工艺验证结果

在优化条件(超声功率105W，超声时间40min，料液比1∶25，提取温度75℃)下对此优化结果进行验证，实际测定块菌多糖提取率为3.48%，与预测值基本一致(相对误差)，再次验证了回归方程的正确性。

3 结论

采用超声中性水浸提法提取块菌多糖，其优化的工艺参数为:超声功率104.7W，超声时间40.4min，料液比1∶24.65，提取温度75.05℃。依据现有实验条件经过微调，其最佳的工艺参数为:超声功率105W，超声时间40min，料液比1∶25，提取温度75℃。通过3批次的验证实验，其多糖提取率平均3.48%，与预测值接近，证明了本实验设计与分析方法较准确可靠。

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Optimization of extraction technique of polysaccharides from truffles via response surface methodology(RSM)

ZHANG Shi-qi1，2，KAN Jian-quan1，2，*
(1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China; 2.Chongqing Key Laboratory of Produce Processing and Storage，Chongqing 400715，China)

Optimal processing parameters for ultrasonic-assisted extraction of truffle polysaccharide in neutral water medium were determined.On the basis of single factor experiments and according to Box-Behnken test design principles，the method of response surface method(RSM)for optimal parameters was adopted.Finally，the optimal extraction process was obtained as follows:ultrasonic power 105W，ultrasonic processing time 40min，ratio of liquid to sample 25∶1，extraction temperature 75℃.Under these conditions，the yield of polysaccharide truffles reached 3.48%.The model turned out to be with good fitting degree and minor error.

truffles;polysaccharide;response surface methodology;ultrasonic extraction conditions

TS201.2

B

1002-0306(2011)11-0345-05

块菌(Perigord Truffle)又称块菇、松露、无娘藤、猪拱菌［1］等，属于子囊菌亚门、块菌目、块菌科、块菌属［2-3］，是地下菌(Hypogeous fungi)中的一个比较重要的子囊菌类群。子实体在土壤中生长，除个别种类在成熟时半露出土表外，大部分种类自始至终埋生于地下，是与树木共生的外生菌根型药食两用真菌。块菌的主要活性成分有α-雄烷醇、神经酰胺、块菌多糖(polysaccharide of Tuber sinense，PST)等。研究表明，块菌多糖作为一种新的真菌多糖，水溶性好、毒性低、抑制肿瘤作用明显，可望开发成抗肿瘤免疫疗法的药物［4-5］。现有的提取多糖的方法主要为碱提取法、酸提取法和中性水提取法［6-7］，通过实验验证，酸法提取块菌多糖效果不明显且在酸性的条件下糖苷键容易被破坏，碱法提取后用90%的乙醇醇沉时多糖的凝沉效果不好且提取率相比热水浸提没有很明显的提高。因此，考虑到后期实验的纯化工作，本实验采用超声中性水浸提法。

2010-11-12 *通讯联系人

张世奇(1983-)，男，硕士研究生，研究方向:食品质量与安全控制。