超声-琥珀酰化复合改性提高大豆分离蛋白乳化性的研究

李 磊，迟玉杰，2，*，王喜波，于 滨

(1.东北农业大学食品科学学院，黑龙江哈尔滨150030; 2.大豆生物学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030)

超声-琥珀酰化复合改性提高大豆分离蛋白乳化性的研究

李 磊1，迟玉杰1，2，*，王喜波1，于 滨1

(1.东北农业大学食品科学学院，黑龙江哈尔滨150030; 2.大豆生物学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030)

为提高大豆分离蛋白的乳化性，采用超声和琥珀酰化两种方法对大豆分离蛋白进行复合改性。通过单因素实验研究底物浓度、超声功率、超声时间、琥珀酸酐添加量和酰化反应温度对大豆分离蛋白乳化性的影响。在单因素实验的基础上，运用响应面法优化出超声-琥珀酰化改性大豆分离蛋白的适宜条件:超声功率569.36W、超声时间9.79min、酰化温度49.72℃。该条件下制得的改性大豆分离蛋白的乳化活性和乳化稳定性与未改性的大豆分离蛋白相比较，分别提高了3.05倍和4.65倍。

大豆分离蛋白，超声波处理，琥珀酰化，乳化性，响应面法

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆分离蛋白 哈高科大豆食品有限责任公司，蛋白质含量87.11%，水分含量5.84%，脂肪含量1.95%，灰分含量4.92%;琥珀酸酐 国药集团化学试剂有限公司;大豆油 北海粮油工业(天津)有限公司;十二烷基磺酸钠(SDS) 化学纯;其他试剂均为分析纯。

290型喷雾干燥机 瑞士BüChi公司;JY92-2D超声仪 宁波新芝生物科技股份有限公司;FS-1可调高速匀浆机 金坛市荣华仪器制造有限公司;722型分光光度计 天津市普瑞斯仪器有限公司; LD4-2A型离心机 北京医用离心机厂;其它仪器均为实验室常规仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 超声-琥珀酰化大豆分离蛋白的制备 将SPI配成一定浓度的蛋白液，置于隔音箱中，将超声仪探头插入蛋白液面2cm，在超声波作用下处理一定时间(温度控制在20～30℃)，然后将蛋白液置于恒温水浴锅中，保持一定温度，用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.0～8.5，在搅拌的条件下分批加入琥珀酸酐，反应过程中用2mol/L NaOH溶液调节pH保持在8.0～8.5范围内，待pH稳定30min后，反应结束，进行离心水洗:调节蛋白液pH至4.0，搅拌30min，4000r/min离心20min，取沉淀部分，重复离心水洗。水洗三次后回调pH至7.0，喷雾干燥即得超声-琥珀酰化SPI。

1.2.2 乳化性的测定［12］蛋白样品以0.2%(W/V)的浓度溶解于pH7.0，0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液中，取30mL蛋白液加入10mL大豆油，10000r/min均质1min以形成乳化液，分别在均质后0、10min时从底部吸取100μL，用10mL 0.1%(W/V)的SDS稀释后在500nm(OD500)条件下测定吸光值，以0min时的吸光值表示乳化活性(EA)，乳化稳定性(ES)用乳化稳定指数(ESI)表示:

式中:A0为0min时的吸光值;ΔT为时间差，本实验中是10min;ΔA为ΔT内的吸光值差。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 底物浓度对超声-琥珀酰化SPI乳化性的影响 超声功率为500W，超声时间10min，琥珀酸酐添加量为SPI干基的10%，酰化反应温度40℃，底物浓度取2%、4%、6%、8%、10%考察反应后各蛋白样品的乳化活性和乳化稳定性。

1.2.3.2 超声功率对超声-琥珀酰化SPI乳化性的影响 底物浓度为6%，超声时间10min，琥珀酸酐添加量为SPI干基的10%，酰化反应温度40℃，超声功率取150、300、450、600、750W考察反应后各蛋白样品的乳化活性和乳化稳定性。

1.2.3.3 超声时间对超声-琥珀酰化SPI乳化性的影响 底物浓度为6%，超声功率500W，琥珀酸酐添加量为SPI干基的10%，酰化反应温度40℃，超声时间取4、7、10、14、17min考察反应后各蛋白样品的乳化活性和乳化稳定性。

1.2.3.4 琥珀酸酐添加量对超声-琥珀酰化SPI乳化性的影响 底物浓度为6%，超声时间为10min，超声功率500W，酰化反应温度40℃，琥珀酸酐添加量分别取SPI干基的1%、5%、10%、15%、20%考察反应后各蛋白样品的乳化活性和乳化稳定性。

1.2.3.5 琥珀酰化反应温度对超声-琥珀酰化SPI乳化性的影响 底物浓度取6%，超声时间为10min，超声功率500W，琥珀酸酐添加量为SPI干基的10%，酰化反应温度取20、30、40、50、60℃考察反应后各蛋白样品的乳化活性和乳化稳定性。

1.2.4 响应面实验设计 在单因素实验基础上，根据Box-Behnken实验设计原理，以超声时间A、超声功率B、酰化反应温度C为自变量，以乳化活性为响应值，设计了三因素三水平的响应面分析实验。对实验数据结果采用Design-Expert7.1软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验分析

2.1.1 底物浓度对超声-琥珀酰化SPI乳化性的影响 从图1可以看出，随着底物浓度的增加，SPI的乳化活性和乳化稳定性显著增加，当底物浓度大于6%时，乳化活性和乳化稳定性则呈下降趋势。当底物浓度逐渐增大时，超声波的空化作用增强，使SPI的分子展开，疏水基团朝向脂质而极性部分朝向水相，从而使得SPI乳化性提高;在酰化反应中，当底物浓度增大时，处于溶解状态的SPI分子较多，单位体积溶液中能与琥珀酸酐发生有效碰撞的SPI分子数量增多，反应速度呈上升趋势，乳化性提高。当底物浓度继续增大时，在相等时间内，超声波空化作用减弱，SPI分子结构改变程度变小，导致乳化性下降;并且，在酰化反应体系中，浓度增加到一定程度，呈不溶状态的SPI分子增多，不能与琥珀酸酐分子发生有效碰撞［13］，酰化反应速度降低，导致SPI乳化活性和乳化稳定性下降。选取6%为适宜的底物浓度。

图1 底物浓度对SPI乳化性的影响

2.1.2 超声功率对超声-琥珀酰化SPI乳化性的影响 从图2可以看出，随着超声功率的增大，SPI的乳化活性和乳化稳定性呈上升的趋势，在超声功率达到600W时，乳化活性和乳化稳定性达到最高值。超声波处理使SPI分子展开，结构变得疏松，琥珀酸酐分子和SPI的反应基团更容易结合，从而提高SPI的乳化活性和乳化稳定性。功率继续增大，超声波作用增强使得SPI变性程度增大，不溶性SPI的含量增多，导致SPI乳化性下降。选取600W为适宜的超声功率。

2.1.3 超声时间对超声-琥珀酰化SPI乳化性的影响 从图3中可以看出，在4～10min范围内，随着超声时间的延长，SPI的乳化活性和乳化稳定性逐步上升，当超声处理时间达到10min后，SPI的乳化性呈下降趋势。因此，选取10min为适宜的超声处理时间。

表3 乳化活性的实验结果方差分析表

图2 超声功率对SPI乳化性的影响

图3 超声时间对SPI乳化性的影响

2.1.4 琥珀酸酐添加量对超声-琥珀酰化SPI乳化性的影响 从图4可以看出，随着琥珀酸酐添加量的增大，SPI的乳化活性和乳化稳定性也逐步增大。琥珀酸酐添加量的增大使得引入的亲水基团增多，SPI溶解度增大，从而提高了其乳化活性;琥珀酰化SPI净负电荷的增加，亚基的伸展，使得形成的乳状液中液珠的排斥作用增大，液珠不易聚结，从而提高了SPI的乳化稳定性。当琥珀酸酐添加量达10%以后，乳化活性及乳化稳定性增加幅度趋于平缓，其原因可能是琥珀酸酐的用量增加到一定程度时，相对于蛋白质分子而言，已趋于饱和，此时再增加琥珀酸酐的用量，对反应的促进作用减小［14］。从经济角度考虑，确定后续实验的琥珀酸酐添加量为SPI的10%。

2.1.5 酰化温度对超声-琥珀酰化SPI乳化性的影响 从图5可以看出，随着酰化反应温度的升高，溶液运动的速率增加，SPI分子的伸展程度较高，有利于琥珀酸酐酰化反应的进行，溶解度增大，使得乳化活性和乳化稳定性呈上升趋势。温度达到60℃时，SPI分子变性程度过大，失去反应活性，导致乳化活性和乳化稳定性下降。因此选取50℃为适宜的酰化反应温度。

图4 琥珀酸酐添加量对SPI乳化性的影响

图5 酰化温度对SPI乳化性的影响

2.2 超声-琥珀酰化SPI乳化活性的响应面分析

通过单因素实验，确定了响应面实验因素的0水平为:底物浓度为6%，琥珀酸酐的添加量为SPI的10%，酰化反应的pH控制在8.0～8.5范围内。实验的因素和水平取值见表1。

表1 响应面实验因素水平表

响应面设计方案和实验结果见表2，利用Design -Expert7.1软件对实验结果进行二次回归分析，计算SPI乳化活性Y的回归方程并进行方差分析(见表3)。乳化活性Y的标准回归方程为:

由表3的方差分析结果可以看出，所得回归方程极显著，且失拟检验不显著，这说明用方程Y拟合3个因素与乳化活性之间的关系是可行的。从3因素对超声-琥珀酰化SPI的乳化活性的影响来看，Y回归方程的一次项A、B对超声-琥珀酰化SPI的乳化活性均有显著影响，并且二次项A2、B2、C2以及交互项中的AC也对乳化活性有显著的影响，其他因素影响不显著，这表明响应值的变化相当复杂，各个实验因素对响应值的影响呈二次关系，且3因素之间存在交互作用。对回归方程进行中心标准化处理，回归方程Y一次项回归系数的绝对值大小均依次为B、A、C，表明3个因素对乳化活性影响顺序均为:超声功率＞超声时间＞酰化温度。

表2 响应面设计方案和实验结果

分别将模型中的超声时间(A)、超声功率(B)、酰化温度(C)的其中一个因素固定在0水平，得到另外两个因素交互作用对乳化活性Y的子模型，并根据模型分别绘制响应面图，见图6。

图6 超声-琥珀酰化SPI乳化活性的响应面图

通过响应面图可以直观地反映实验条件对超声-琥珀酰化SPI乳化活性的影响。从图6可以看出，3个因素与Y呈抛物线关系，随着各因素值的增加，Y先呈不同程度的上升，但当各因素达到一定的值后，继续增加，Y呈下降趋势，这与单因素的实验结果相同。并且由图6b和图6c可以看出，在实验温度范围内，与超声时间和超声功率两个因素相比较，酰化温度对SPI乳化活性的影响相对较小。

2.3 验证实验

通过模型，采用Design-Expert 7.1软件优化反应条件，得出超声-琥珀酰化复合改性提高SPI乳化活性的最适工艺条件为:超声功率569.36W、超声时间9.79min、酰化温度49.72℃、底物浓度6%、琥珀酸酐添加量10%、pH8.0～8.5。在此条件下，超声-琥珀酰化SPI乳化活性(OD500)的预测值为0.977，而实际测得超声-琥珀酰化SPI的乳化活性(OD500)为0.962，实际值与预测值之间的相对误差在±1%以内，说明采用响应面法优化得到的工艺条件准确可靠，按照建立的模型进行预测实际实验是可行的。

由表4可以看出，超声-琥珀酰化复合改性能有效提高SPI的乳化性。通过超声和琥珀酰化复合改性制得的SPI与未改性的SPI相比较，乳化活性和乳化稳定性均有着大幅度的提高，分别提高了3.05倍和4.65倍。

表4 琥珀酰化SPI与未改性SPI乳化活性和乳化稳定性的比较

3 结论

3.1 通过响应面分析得出各因素对超声-琥珀酰化SPI乳化活性的影响顺序为:超声功率＞超声时间＞酰化温度。

3.2 利用响应面法优化得到超声-琥珀酰化SPI乳化活性的工艺条件为:超声功率569.36W、超声时间9.79min、酰化温度 49.72℃。该条件下制备的超声-琥珀酰化SPI的乳化活性(OD500)为0.962，与预测值的相对误差在±1%以内，说明利用本实验建立的模型的优化结果与实际情况吻合。

3.3 超声-琥珀酰化复合改性能有效提高SPI的乳化性。通过优化得到的工艺条件制备的超声-琥珀酰化SPI与未改性的SPI相比较，乳化活性和乳化稳定性分别提高了3.05倍和4.65倍。

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Improving the emulsibility of soybean protein isolate by ultrasonic and succinylation modification

LI Lei1，CHI Yu-jie1，2，*，WANG Xi-bo1，YU Bin1
(1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China; 2.Administration of Education Key Laboratory of Soybean Biology，Harbin 150030，China)

In order to improve the emulsibility of soybean protein isolate(SPI)，ultrasonic processing and succinylation were used to modify the proteins.The effects of substrate concentration，ultrasonic power，ultrasonic time，the ratio of succinic anhydride，and the temperature of acylation reaction on the emulsifying activity and emulsion stability were studied by single factor experiments.Through the response surface methodology，the optimal conditions were as follows:ultrasonic power 569.36W，ultrasonic time 9.79min，and reaction temperature 49.72℃.Comparing to those of raw SPI，the emulsifying activity and emulsion stability of the proteins prepared under the optimal conditions had improved 3.05 times and 4.65 times，respectively.

SPI;ultrasonic processing;succinylation;emulsibility;response surface methodology

TS201.2+1

A

1002-0306(2011)03-0123-05

大豆分离蛋白(SPI)因其营养价值高，并且具有乳化性、溶解性、吸水性、吸油性等功能性质，而被作为一种重要的功能性辅料广泛应用于食品加工中［1］。其中乳化性是SPI一种重要的功能性质，添加到食品中可以起到改善口感、稳定体系的乳化状态等作用［2］。然而，天然SPI的乳化性尚不能满足现代食品加工中的需要，因此需要对其进行改性。蛋白质改性方法主要有物理改性、化学改性、酶法改性。其中，酶法改性所用的酶制剂价格昂贵，限制了其在工业生产中的应用［3］;物理改性和化学改性由于成本低、设备要求不高等优点而成为蛋白质改性的主要手段［4-5］。其中，超声波处理和酰化反应是蛋白非酶改性中常用的方法，两种方法对不同蛋白乳化性的改善效果已经得到大量验证［6-11］。然而，采用这两种改性方法共同作用于SPI以提高乳化性的研究尚鲜见报道。本研究采用超声波处理和琥珀酰化两种方法对SPI进行复合改性，研究不同底物浓度、超声时间、超声功率、琥珀酸酐添加量和反应温度对SPI乳化性的影响，并应用响应面方法对反应条件进行优化，建立乳化性与各因素间的数学模型，以利于实现工艺过程的控制并满足食品加工对高乳化性SPI的需求。

2010-01-27 *通讯联系人

李磊(1983-)，男，硕士，研究方向:农产品加工。

教育部博士点基金(20070224001);黑龙江省自然科学重点基金项目(ZD200902)。