骆驼蓬灵单独和与洗必泰联合对抗金黄色葡萄球菌悬浮菌和生物膜的抗菌活性研究

申凤鸽 邢明勋 刘丽慧等

摘要：采用微量稀释法测骆驼蓬灵和洗必泰（ＣＨＧ）单独抗金黄色葡萄球菌悬浮菌和生物膜的最小抑菌浓度（ＭＩＣ）和最小杀菌浓度（ＭＢＣ）；棋盘稀释法测定两种药物联合时的协同效果；以及激光共聚焦采集图片检测部分联合的效果。结果表明，骆驼蓬灵和ＣＨＧ联合具有协同抗菌效果。在悬浮菌试验中，９株显示抗浮游菌协同活性，在生物膜试验中，１１株显示协同抗生物膜活性。其余菌株显示相加活性，本试验中无颉颃作用。初步探索了体外试验协同作用的原因，为克服金黄色葡萄球菌耐药提供了一个可供选择的方法。

关键词：骆驼蓬灵；洗必泰；协同作用；抗菌活性

中图分类号：ＴＱ４６４．４文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）16－3346-05

Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Eｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｈａｒｍａｌｉｎｅ Aｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ Cｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Cｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ Dｉｇｌｕｃｏｎａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ Cｌｉｎｉｃａｌ Iｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Gｒｏｗｎ ｉｎ Pｌａｎｋｔｏｎｉｃ ａｎｄ Bｉｏｆｉｌｍ Cｕｌｔｕｒｅｓ

ＳＨＥＮ Ｆｅｎｇ－ｇｅ，ＸＩＮＧ Ｍｉｎｇ－ｘｕｎ，ＬＩＵ Ｌｉ－ｈｕｉ，ＹＵAN Ｐｅｎｇ，ＳＨＩ Ｑｉ－ｙｕｎ，ＹＵ Ｌｕ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｉｓ， Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００６２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ （ＭＩＣ） ａｎｄ ｍｉｎｉｍｕｍ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（ＭＢＣ） ｏｆ ｈａｒｍａｌｉｎｅ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ ｄｉｇｌｕｃｏｎａｔｅ （ＣＨＧ） ａｇａｉｎｓｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ or ｂｉｏｆｉｌｍ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｂｒｏｔｈ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ. Ｃｈｅｑｕｅｒｂｏａｒｄ ａｓｓａｙｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ， ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈａｒｍａｌｉｎｅ ａｎｄ ＣＨＧ； ａｎｄ ｓｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｈａｒｍａｌｉｎｅ ａｎｄ ＣＨＧ ｓｈｏｗｅｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｂｉｏｆｉｌｍ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｓ． ａｕｒｅｕｓ． Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈａｒｍａｌｉｎｅ ａｎｄ ＣＨＧ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ９ ａｎｄ １１ ｏｆ ｔｈｅ １３ Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｈｅｎ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｂｉｏｆｉｌｍ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｎｏ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ａｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｅｓｔｅｄ． Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈａｒｍａｌｉｎｅ ａｎｄ ＣＨＧ ａｇａｉｎｓｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｓ． ａｕｒｅｕｓ （ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｂｉｏｆｉｌｍ） ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｍｉｇｈｔ ｐｒｏｖｉｄｅ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ｂｏｔｈ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｆｉｌｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｈａｒｍａｌｉｎｅ； ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ ｄｉｇｌｕｃｏｎａｔｅ； ｓｙｎｅｒｇｙ； ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ

金黃色葡萄球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）是革兰氏阳性菌，是一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，能导致人体的局部和全身感染［１］，此外还能导致皮肤感染，食物中毒，关节炎，肺炎，脑膜炎，脊髓炎，心内膜炎和严重的并发症［２］。

金黄色葡萄球菌能产生生物膜，生物膜能将细菌表面粘连在一起，形成复杂的生物群落，这种复杂的生物群落嵌入自身产生的多糖基质中，能抵抗环境和微生物的威胁［３］。据报道，微生物因子抗生物膜的最低抑菌浓度（ＭＩＣｓ）是悬浮菌的１０～１ ０００倍［４］。因此，急需开发新的药物去治疗金黄色葡萄球菌的生物膜感染。

洗必泰（ＣＨＧ）是一种很普遍的抗微生物因子，在临床实践中用于皮肤的消毒。洗必泰（ＣＨＧ）具有很宽的抗菌谱，可抗多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，如金黄色葡萄球菌［５］。尽管ＣＨＧ具有抗微生物活性，但是它的水和含醇制剂对皮肤的穿透力很弱，而细菌能在皮肤的深层存活［６］。因此，开发有效的和迅速穿透皮肤深层的消毒剂是很必要的，以预防侵入相关的皮肤感染［７］。

植物和其他的天然物质是新的抗微生物因子或协作剂的有效资源［８］。研究显示其对耐药的菌株有较宽的抗菌谱［９］。骆驼蓬灵是一种生物碱，是骆驼蓬（Peganum harmala）种子提取物的主要成分，很多体外研究显示它具有抗菌活性［１０］。研究表明，这种生物碱具有抗细菌、抗肿瘤、抗血孢子虫、抗癌、抗血管舒张和抗原虫的作用［１１，１２］。目前尚未发现骆驼蓬灵对金黄色葡萄球菌悬浮菌和生物膜的活性影响的相关报道。

本试验应用了微量稀释法和棋盘法调查骆驼蓬灵单独和与洗必泰联合抗金黄色葡萄球菌的活性。

1材料和方法

1．１材料

甘果红琼脂：０．０８ ｇ甘果红（Ｈｏｐｋｉｎｓ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｌｔｄ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ），５ ｇ蔗糖（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）和１ ｇ琼脂粉（Ｏｘｏｉｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，ＵＫ）与９８ ｍＬ脑心浸液（Ｏｘｏｉｄ）混合制得，高压灭菌，备用。Ｍｕｅｌｌｅｒ-Ｈｉｎｔｏｎ ａｇａｒ （ＭＨＡ） ａｎｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ-Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈ（ＭＨＢ） （Ｏｘｏｉｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，ＵＫ）按说明书配制，高压灭菌，备用。２０％的洗必泰（CHG）和骆驼蓬灵均购自美国 Ｓｉｇｍａ 公司。葡萄糖购自于Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。磷酸缓冲盐水（ＰＢＳ）按说明书配置。９６孔、６孔板及玻片购自于Ｎｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｔｄ。

1．２菌株

１２株临床分离株从吉林大学第一附属医院分离得到，ＡＴＣＣ ２９２１３购自于中国医学微生物菌种保藏中心（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＣＭＣＣ）。细菌在ＭＨＢ或ＭＨＡ（Ｏｘｏｉｄ， Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ， ＵＫ）上３７ ℃培养。

1．３药物准备

骆驼蓬灵用含０．１ ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４的去离子水配成２０ ４８０ μｇ／ｍＬ，-７０ ℃储存。ＣＨＧ用ＭＨＢ稀释成５１２ μｇ／ｍＬ，备用。

1．４细菌悬液的准备

菌株在ＭＨＡ板培养，３７ ℃过夜。挑单菌落与ＭＨＢ中摇床过夜，ＯＤ６６０nm ０．１（约１０８ ＣＦＵ／ｍＬ）。接种物在ＭＨＢ中稀释，使菌液的浓度到１０６ ＣＦＵ／ｍＬ。

1．５悬浮菌的微量稀释法药物敏感试验

ＣＨＧ和骆驼蓬灵的最低抑菌浓度（ＭＩＣ）通过倍比稀释法按ＣＬＳＩ原则［１３］测得。在９６孔板中用ＭＨＢ将抗菌药物做倍比稀释，得到１００ μＬ的一系列药液。每孔加入稀释好的抗菌药物１００ μＬ，每孔含菌１×１０５ＣＦＵ；只加培养基的为对照孔；将９６孔板置于３７ ℃培养２４ ｈ。肉眼未见细菌生长的最低药物浓度即为该药的最低抑菌浓度（ＭＩＣ）。所有抑菌的孔中取适量液体按原来的次序涂于ＭＨ琼脂板上，３７ ℃培养２４ ｈ，肉眼未见细菌生长的最低药物浓度为最小杀菌浓度（ＭＢＣ）。试验重复３次。

1．６悬浮菌的棋盘测定试验

ＣＨＧ与骆驼蓬灵间的协同作用是经微量棋盘测定法测定的［１４］。取５０ μＬ用ＭＨＢ倍比稀释的骆驼蓬灵（１／３２×ＭＩＣ~４×ＭＩＣ）加于９６孔板的横行，５０ μＬ ＣＨＧ的浓度梯度依次从１／２５６×ＭＩＣ到４×ＭＩＣ加于竖列。在孔中加入１００ μＬ浓度为１０６ ＣＦＵ／ｍＬ的菌液。第１２列作为对照，每孔分别加２００ μＬ ＭＨＢ或１００ μＬ １０６ＣＦＵ／ｍＬ 的菌液和１００ μＬ培养基。３７ ℃培养２４ ｈ。通过计算分级抑制浓度指数（ＦＩＣＩ）来评价药物抗菌作用［１５］。ＦＩＣＩ＝（ＭＩＣａ联合／ＭＩＣａ单药）＋（ＭＩＣｂ联合／ＭＩＣｂ单药）。ＦＩＣＩ≤０．５为协同；ＦＩＣＩ＞４．０为颉颃；０．５＜ＦＩＣＩ≤４为相加。试验重复２次。

1．７生物膜的建立

取能形成生物膜的菌株液２００ μＬ，浓度为１×１０５ ＣＦＵ／ｍＬ，加于９６孔板，３７ ℃培养４８ ｈ。

1．８生物膜的微量稀释药敏试验

弃去形成生物膜的９６孔板中的悬液，用２５０ μＬ ＰＢＳ洗去悬浮的残余菌液。用ＭＨＢ倍比稀释的ＣＨＧ和骆驼蓬灵。２００ μＬ药物稀释液按顺序加入各孔，对照孔只加PBS液200 μＬ。３７ ℃培养２４ ｈ。弃去悬液，用ＰＢＳ洗一次，加入２５０ μＬ ＰＢＳ，５０ Ｈｚ超声波震荡３０ ｍｉｎ，每孔的２５０ μＬ液体分别涂于ＭＨＡ上，制备生物膜［１６］，３７ ℃培养２４ ｈ。肉眼可见与对照孔菌量一样或少于对照孔（加ＰＢＳ的孔）的最低药物浓度为最小抑制膜生长的浓度（ＭＢＩＣ），未见细菌生长的最小药物浓度为最小杀生物膜浓度（ＭＢＢＣ）。试验重复３次。

1．９生物膜的棋盘测定试验

形成生物膜后，按上述方法用ＰＢＳ洗１次，分别取１００ μＬ ＣＨＧ（１／２５６×ＭＩＣ~４×ＭＩＣ）和骆驼蓬灵（１／１６×ＭＩＣ~４×ＭＩＣ）稀释液加于９６孔板中，ＣＨＧ加到豎列孔中，骆驼蓬灵加到横行。３７ ℃培养２４ ｈ。弃去药液后再用ＰＢＳ洗１次，用以前描述的方法得到生物膜，每孔２５０ μＬ涂到ＭＨＡ上，３７ ℃ ２４ ｈ培养后，评估ＦＩＣＩ值。

1．１０激光共聚焦（ＣＬＳＭ）

通过激光共聚焦摄像验证ＣＨＧ和骆驼蓬灵单独和联合后的活性。２ ｍL菌液加于６孔板的含有灭菌玻片的各孔中，培养４８ ｈ，形成生物膜。玻片用ＰＢＳ洗一次，将玻片移入含受试条件的药液中，培养２４ ｈ。然后用ＰＢＳ洗，用ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）的说明书进行染色。用 Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００激光共聚焦显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）ａ×６０ 物镜采集图像．。采用Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ｖｅｒｓｉｏｎ １．７．３．０．分析图像和输出图像。

2结果

2．１ＣＨＧ和骆驼蓬灵对抗悬浮菌和生物膜的微量药敏试验

笔者对１２株临床分离株和１株质控株ＡＴＣＣ ２９２１３进行了调查，ＣＨＧ和骆驼蓬灵单独对抗金黄色葡萄球菌的悬浮菌和生物膜的活性，见表１。

2．２ＣＨＧ和骆驼蓬灵对抗悬浮菌和生物膜的棋盘试验

在悬浮菌中ＣＨＧ联合骆驼蓬灵的抗菌活性，见表２。结果显示，在受试的悬浮菌中有９株具有协同作用，其ＦＩＣＩ值０．３７５～０．５００；４株有相加作用，其ＦＩＣＩ值０．750~１．500。

在对抗生物膜的试验中，受试的１３株金黄色葡萄球菌中１１株具有协同活性，ＦＩＣＩ值为０．２５0~０．５０0。Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ３６２９和Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ３２１８显示了相加的抗菌活性，其ＦＩＣＩ值分别是０．７５0和１．500（表３）。在所有试验中均未出现颉颃作用。

2．３激光共聚焦试验

通过激光共聚焦试验评估ＣＨＧ和骆驼蓬灵单独和联合抗生物膜活性（图１）。处理２４ ｈ后对照组可见大量的活菌生长（图１－Ｅ），与对照相比，４×ＭＩＣ骆驼蓬灵处理后可见大量的细菌死亡，仅留部分菌在玻片上（图１－Ｃ），４×ＭＩＣ ＣＨＧ处理后与之相似，可见大量的细菌死亡（图１－Ａ）。用ＣＨＧ和骆驼蓬灵联合处理后，图片显示出极强的杀菌效果，仅有少量的菌存活（图１－Ｆ）。

４讨论

在本研究中，我们用棋盘稀释法初步分析了药物－药物相互作用。我们发现骆驼蓬灵抗金黄色葡萄球菌的活性较弱，但与ＣＨＧ联合时具有较好的协同效果。据报道发现桉树油和ＣＨＧ具有较好抗金黄色葡萄球菌生物膜活性［１７］，这与我们的结果一致。此外，有报道发现骆驼蓬灵具有毒性，但是其毒性很低［１８］。据研究发现生物膜能增加了药物的耐药性［１９］。同时，ＣＨＧ和骆驼蓬灵对抗生物膜时有较高的ＭＢＣｓ值（≥５１２ μｇ／ｍL）。

在本研究中，骆驼蓬灵联合ＣＨＧ抗受试的金黄色葡萄球菌的悬浮菌和生物膜均具协同效果。此外，在抗生物膜的试验中，结果显示二者联合使用具有协同的作用，仅在Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ３６２９和Ｓ． ａｕｒｅｕｓ ３２１８表现出相加的效果。重要的是，我们对棋盘稀释法测得的结果用ＣＬＳＭ进行了进一步的证实。ＣＬＳＭ的图像显示骆驼蓬灵不仅能强有力地杀死细菌，而且也能很好地清除生物膜（图１－Ｄ）。与之相似的是，高浓度的ＣＨＧ能有效地清除生物膜，但是它的杀菌作用较弱（图１－Ｂ）。

在临床中，ＣＨＧ广泛被用于皮肤消毒。ＣＨＧ具有亲水和疏水基因，研究表明生物膜的细胞外基质所带的阴离子阻碍了ＣＨＧ阳离子的扩散，且能使细胞外基质的理化性质和三级结构改变［５］。二氢骆驼蓬碱和骆驼蓬灵是骆驼蓬种子提取物的主要生物碱，它用于控制自热感染和实验感染的牛血孢子虫［２０］。也有研究表明骆驼蓬灵氨基氧化酶抑制子是一个Ｎａ＋／Ｃａ２＋交换的弱的抑制子［２１］，它对ＮＨＥ（Ｎａ＋／Ｈ＋交换）亚型显示出不同的亲和力［２２］。我们发现骆驼蓬灵与ＣＨＧ联合时在受试多数菌株中表现协同活性。此外，当骆驼蓬灵和ＣＨＧ联合时能导致生物膜的结构破坏和细菌的死亡。骆驼蓬灵对抗金黄色葡萄球菌生物膜的机制目前尚不清楚。

综上所述，尽管骆驼蓬灵单独使用时的抗菌活性较弱，但与ＣＨＧ联合对抗黄色葡萄球菌分离株和质控株ＡＴＣＣ ２９２１３有潜在协同活性。该发现具有一定的临床价值。同时，对开发新型抗耐药金黄色葡萄球菌药物具有重要价值。

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［１５］ ＫＡＲＰＡＮＥＮ Ｔ Ｊ，ＷＯＲＴＨＩＮＧＴＯＮ Ｔ，ＨＥＮＤＲＹ Ｅ Ｒ，ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ ｄｉｇｌｕｃｏｎａｔｅ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｏｉｌ， ｔｅａ ｔｒｅｅ ｏｉｌ ａｎｄ ｔｈｙｍｏｌ ａｇａｉｎｓｔ ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｆｉｌｍ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， ２００８， ６２（５）：１０３１-１０３６．

［１６］ ＡＤＡＭＳ Ｄ，ＱＵＡＹＵＭ Ｍ，ＷＯＲＴＨＩＮＧＴＯＮ Ｔ，ｅｔ ａｌ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ２％ ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ ｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｉｎ ７０％ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｓｋｉｎ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔ［Ｊ］． Ｊ Ｈｏｓｐ Ｉｎｆｅｃｔ，２００５，６１（４）：２７８-２９０．

［１７］ ＨＥＮＤＲＹ Ｅ， ＷＯＲＴＨＩＮＧＴＯＮ Ｔ， ＣＯＮＷＡＹ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｏｉｌ ａｎｄ １，８－ｃｉｎｅｏｌｅ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ ｄｉｇｌｕｃｏｎａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｆｉｌｍ ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００９，６４（６）：１２１９-１２２５．

［１８］ ＤＩ Ｃ， ＤＥＬＭＡ Ｆ， ＯＬＬＩＶＩＥＲ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｔａ－ｃａｒｂｏｌｉｎｅ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｈａｒｍａｎｅ， ｈａｒｍｉｎｅ， ａｎｄ ｈａｒｍａｌｉｎｅ ｔｏｗａｒｄ ｐａｒａｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ［Ｊ］． Ｅｘｐ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ，２００４，１０６（３－４）：６７-７４．

［１９］ ＳＡＧＩＮＵＲ Ｒ， ＳＴDENIS Ｍ，ＦＥＲＲＩＳ Ｗ， ｅｔ ａｌ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｂｉｏｆｉｌｍｓ ｆｒｏｍ ｉｍｐｌａｎｔ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，２００６，５０（１）：５５-６１．

［２０］ ＦＡＮ Ｂ， ＬＩＡＮＧＪ，ＭＥＮ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ａｌｋａｌｏｉｄ ｏｆ Ｐｅｇａｎｕｍｈａｒｍａｌａ Ｌ． ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｈａｅｍｏｓｐｏｒｉｄｉａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］． Ｔｒｏｐ Ａｎｉｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｄ，１９９７，２９（Ｓｕｐｐｌ． ４）：７７-８３．

［２１］ ＳＵＬＥＩＭＡＮ Ｍ Ｓ， ＲＥＥＶＥＳ Ｊ Ｐ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａ＋－Ｃａ２＋ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｂｙ ｈａｒｍａｌｉｎｅ［Ｊ］． Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃ，１９８７，８８（１）：１９７-２００．

［２２］ ＭＯＲＤＥＣＡＩ Ｐ，ＪＯＮＡＴＨＡＮ Ｗ． Ｓｏｄｉｕｍ／Ｃａｌｃｉｕｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ： ｉｔｓ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］． Pｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Rｅｖｉｅｗｓ，１９９９，

７９（３）：７６３－８５４．