密枝瑚菌多糖提取工艺参数优化

苏凤贤，杨全文，李彩霞，李 鹏

河西学院农业与生物技术学院，张掖734000

密枝瑚菌多糖提取工艺参数优化

苏凤贤，杨全文，李彩霞，李 鹏

河西学院农业与生物技术学院，张掖734000

本文对密枝瑚菌多糖的测定方法和提取工艺参数进行了研究。结果表明，采用硫酸苯酚法测定密枝瑚菌多糖方法简便、准确、灵敏度高、重现性好。在此基础上采取单因素实验和正交分析，得到密枝瑚菌多糖最佳提取工艺参数为料液比1∶20，提取时间3 h，提取温度90℃。在此条件下，多糖提取率为2.23%。

密枝瑚菌;多糖;提取工艺参数

密枝瑚菌(Ramaria stricta(Pers.∶Fr.)Quél.)别名密丛枝，是一类群生于阔叶树的腐木或枝条上的子实体中等大小的真菌，属非褶菌目(Aphyllophorales)枝瑚菌科(Ramariaceae)。该科各属含有很多质地脆嫩、别具风味的食用菌，是我国野生食用菌资源中不可忽视的组成部分［1］。调查发现，密枝瑚菌与森林的关系极为密切，具有风味好、个体大、产量高等特点，在商业上极具开发价值［2］。密枝瑚菌菌肉白或淡黄色、内实，主要分布于山西、黑龙江、吉林、安徽、海南、西藏、四川、河北、广东、云南等地。目前有报导金黄枝瑚菌、红枝瑚菌和黄枝瑚菌对小白鼠肉瘤(S-180)和艾氏癌(EC)有较强的抑制作用［3］，但未见有密枝瑚菌研究报道。食用菌多糖具有免疫调节作用，近年来国内外已对多种食用菌进行了多糖的提取纯化、分离鉴定及功能性研究，灵芝多糖、茯苓多糖、香菇多糖、裂褶多糖等已用于临床［4-8］，食用菌多糖在抗肿瘤、抗衰老、降血糖方面显示出诱人前景。本文采取硫酸-苯酚法对密枝瑚菌多糖的测定方法和提取工艺进行了初步研究，为建立密枝瑚菌多糖科学的测定方法及经济的制备工艺提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

2004年采自张掖市肃南县东柳沟，通过查阅中国大型真菌鉴定属于非(或无)褶菌目枝瑚菌科密枝瑚菌(Ramaria stricta(Pers.∶Fr.)Quél.)［1］。

1.1.2 试剂

葡萄糖﹑乙醇(95%)、浓硫酸﹑苯酚、丙酮、乙醚、H2O2、三氯甲烷、正丁醇，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

722S分光光度计(上海棱光技术有限公司); DKB-501A型超级恒温水槽;LD4-2A离心机(北京医用离心机厂制造);电子天平(Mettler Toledo，0.01 mg/200 g)。

1.3 方法

1.3.1 密枝瑚菌多糖的提取

准确称取0.50 g，经干燥、粉碎、过20目筛的密枝瑚菌粉，置于100 mL锥形瓶中，按料液比1∶20量加入蒸馏水，于恒温水浴锅中恒温提取，浸提完毕后立即冷却，于4000 r/min离心10 min，取上清液，缓慢加入3倍体积的95%乙醇，于4℃冰箱中静置过夜;然后在4000 r/min离心5 min，收集沉淀，依次用80%的乙醇、95%乙醇、乙醚反复洗涤，再于3000 r/ min离心5 min，所得即为密枝瑚菌多糖粗提物，用蒸馏水溶解备用。

1.3.2 测定波长的确定

准确移取一定量的标准品和样品液按硫酸－苯酚法［9］进行显色，然后在400～600 nm测定吸光度以确定最大吸收波长λmax。

1.3.3 标准曲线的制备

精确称取经105℃干燥至恒重的葡萄糖0.1000 g，配制成含葡萄糖100 μg/mL的葡萄糖标准溶液。移取定量葡萄糖标准溶液，使其分别与6% 重蒸苯酚混合，再快速加入浓硫酸摇匀，在室温下反应20 min，然后于λmax处以2.0 mL蒸馏水取代标准葡萄糖使用液作为空白对照测定吸光值。

1.3.4 显色时间的选择

移取葡萄糖标准溶液和供试样品溶液各1.0 mL，置于试管中，依次加入蒸馏水1.0 mL、6%苯酚溶液1.0 mL、浓硫酸5.0 mL，摇匀，在室温下分别显色20、40、60、80 min。反应终止立即放入冷水中冷却，在λmax处测定吸光度，确定反应时间对多糖测定的影响。

1.3.5 精密度试验

分别移取6份供试样品溶液各0.5 mL，置于具塞试管中，按1.3.3项下方法测定吸光值，重复测定6次。

1.3.6 重现性试验

分别移取6份供试样品溶液各0.5 mL，置于具塞试管中，按1.3.3项下方法测定吸光值，并计算多糖含量。

1.3.7 加标回收试验

移取5份供试样品溶液各0.5 mL，分别加入100 μg/mL的葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，按1.3.3项下方法测定吸光值，计算加标回收率。

1.3.8 密枝瑚菌多糖得率

采用硫酸-苯酚比色法，以葡萄糖为标准样液，将密枝瑚菌粗多糖溶解并稀释至适当浓度，移取0.5 mL粗多糖液，按1.3.3项下方法测定吸光值，并按如下公式计算多糖得率。

式中:C为标准曲线计算出的多糖含量(μg);D为提取液总体积(mL);V为测定液体积(mL);W为样品质量(g)。

1.3.9 正交试验

在单因素实验基础上，选择浸提温度、浸提时间、料液比为考察因素，采用L9(34)正交试验表设计［10］，因素水平见表1，并以粗糖提取得率为考察指标，筛选最佳提取工艺条件。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

2 结果与分析

2.1 密枝瑚菌多糖的定量分析

2.1.1 最大吸收波长

标准葡萄糖溶液与样品溶液显色后，在460～520 nm区间内有强吸收峰，且最大吸收波长出现在490 nm处，故选择490 nm作为定量测定波长。

2.1.2 标准曲线

根据1.3.3方法制作标准曲线，以葡萄糖含量c(μg)为纵坐标，吸光度(A)为横坐标，绘制吸光度-葡萄糖关系曲线，得回归方程为 y=173.1x+ 1.7061，相关系数R2=0.999。结果表明，葡萄糖在0～80 μg范围内其浓度与吸光度线性关系良好。

2.1.3 显色时间

标准葡萄糖溶液和供试样品溶液显色后，随着时间的延长吸光度呈缓慢下降趋势，所以选择20 min为最佳显色时间。

2.1.4 精密度试验

供试样品显色后，在490 nm处平均吸光度为0.286，RSD=2.14%(n=6)，说明硫酸-苯酚法测定密枝瑚菌多糖含量精密度较高。

2.1.5 重现性试验

供试品溶液中多糖平均含量为1.02%，RSD= 2.07%(n=6)。

2.1.6 加标回收试验

加标回收试验结果如表2所示，说明该法加样回收率较高，相对标准偏差较小，准确度较高。

表2 加样回收率测定结果Table 2 Recoveries of polysaccharide in spiked samples

综上，通过对线性关系、显色稳定性、精密度、重现性、加标回收率的考察，用硫酸-苯酚分光光度法定量分析密枝瑚菌多糖含量简便、准确、灵敏度高、重现性好，该法可用于密枝瑚菌多糖含量的测定。

2.2 密枝瑚菌多糖提取工艺参数分析

2.2.1 料液比对密枝瑚菌多糖得率的影响

选取不同的料液比，分别在90℃下提取1 h，再用浓度95%乙醇沉淀，计算密枝瑚菌多糖得率，结果见图1。

图1 料液比对多糖得率的影响Fig.1 Effects of ratio of material to water on yield of polysaccharides

由图1可知，料液比对多糖的提取效果有一定影响，当料液比从1∶10到1∶20时，多糖得率随料液比的增加而增加;之后，随料液比增加，多糖得率开始下降。因此，料液比以1∶20较为合适。

2.2.2 提取温度对密枝瑚菌多糖得率的影响

以不同提取温度为考察因素，选取料液比为1∶20，提取时间为1 h，计算密枝瑚菌多糖得率，结果见图2所示。

从图2可以看出，多糖得率随提取温度的升高而增加，当提取温度超过90℃ 时，多糖得率上升幅度趋缓，考虑到多糖为活性物质，温度越高对其结构和活性影响越大，故提取温度选取90℃较为合理。

图2 温度对多糖得率的影响Fig.2 Effects of temperature on yield of polysaccharides

2.2.3 提取时间对密枝瑚菌多糖得率的影响

选取料液比为1∶20，提取温度为90℃，在此条件，考察提取时间对多糖得率的影响，结果见图3。

图3 提取时间对多糖得率的影响Fig.3 Effects of time on yield of polysaccharides

由图3可知，提取时间对多糖的提取效果有一定影响。当提取时间小于3 h时，随着提取时间的延长，多糖得率呈现缓慢增长的趋势，当提取时间超过3 h，随时间增加，多糖得率开始下降。因此，选取提取时间为3 h较合适。

2.2.4 正交试验

在单因子实验的基础上进行正交试验，进而优化提取工艺参数，结果如表3和表4所示。

从表3正交试验结果和表4方差分析结果可知，各因素对多糖得率的影响程度依次为A＞B＞C，优化后得最佳提取工艺为A3B3C2，即提取温度为90℃、提取时间为3 h、料液比为1∶20。在此条件下多糖得率为2.23%。

表3 L9(34)正交试验结果Table 3 Results of orthogonal design

表4 提取工艺正交试验方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal design results of extraction process

3 结论

3.1 通过对线性关系、显色稳定性、精密度、重现性、加标回收率的考察，结果表明，采用硫酸-苯酚分光光度法定量分析密枝瑚菌多糖含量简便、准确、灵敏度高、重现性好，方法准确，易于操作。

3.2 在以上试验的基础上，通过单因素试验和正交试验，确定了密枝瑚菌多糖的最佳提取工艺参数为:料液比1∶20，提取温度90℃，浸提时间3 h，在此条件下密枝瑚菌多糖提取率为2.23%。

3.3 本试验首次对密枝瑚菌多糖的测定方法和提取工艺参数进行了初步研究。但密枝瑚菌多糖的组成、结构、药理药效作用还需要更进一步的研究。

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Parameter Optimization of Extraction Technology of Polysaccharides from Ramaria stricta

SU Feng-xian，YANG Quan-wen，LI Cai-xia，LI Peng
College of Agriculture and Biotechnology，Hexi University，Zhang ye 734000，China

The extraction technological parameters and measuring method of polysaccharides in Ramaria stricta(Pers.: Fr.)Quél.were investigated.The results showed that the method of phenol-sulfurc acid was simple，accurate，high sensitivity，and good reproducibility for determining the content of polysaccharides in R.stricta.Based on the results of the single factor and orthogonal experiments，the optimum extraction condition for polysaccharides was obtained as follows: solid-liquid ratio 1∶20，temperature 90℃，and extraction times 3.0 h.Under these conditions，the extraction rate of polysaccharides from R.stricta was 2.23%.

Ramaria stricta;polysaccharides;extraction technological parameter

1001-6880(2011)04-0751-04

2009-11-09 接受日期:2010-06-07

*通讯作者 Tel:86-013085925602;E-mail:lipeng@hxu.edu.cn

S567.3+9

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