上皮紧密连接与炎性肠病的研究进展

蔡文娟（综述），章明放（审校）

（天津市第一中心医院病理科，天津 300192）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）又称肠炎，是一组肠道炎症性疾病的统称。一般指大肠内的炎症，有时候也被用来指小肠内的炎症，主要包括克罗恩病（Crohn disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）。CD可影响消化系统的任何部分，从口腔至肛门都有可能发生跳跃性病变，多发于回肠末端。而UC发病仅限于结肠和直肠部分。黏膜上皮细胞及其细胞间的各种连接结构是肠道抵御外环境中有害物质或病原体入侵肠黏膜组织的关键，是维持肠上皮的选择通透性及其屏障功能的结构基础。肠上皮细胞顶端的紧密连接及与之相邻的黏附连接组成了顶端连接复合体，是调控黏膜屏障的主要组成部分。其中，紧密连接是维持上皮细胞间机械屏障最重要的结构基础。

1 肠上皮紧密连接的结构和功能

紧密连接在冰冻蚀刻电镜下表现为一系列交织的膜内束，由跨膜蛋白和细胞质接头蛋白组成，形成复杂的蛋白网络。跨膜蛋白是紧密连接的主要成分，它们能够穿透紧密连接，将邻近细胞的胞膜连接起来，形成密封结构。最主要的三种跨膜蛋白是occludin、claudin家族（至少包括24个成员）和连接黏附分子（junctional adhesion molecule，JAM）。紧密连接的主要作用是封闭相邻细胞间的接缝，防止溶液中的分子沿细胞间隙渗入体内，从而保证机体内环境的相对稳定，其作用包括:①细胞间隙的顶端形成渗透屏障，调节水和电解质的极向运动，防止大分子物质经肠腔漏到周围组织中。②造成膜质的区域性差异，使这些区域可进行专一的功能活动，如离子的定向转运和大分子吸收，阻止膜中脂类和蛋白质的侧向扩散。③具有一定生理作用，如上皮细胞分化［1］。

2 IBD中紧密连接的破坏

轻中度CD活动时，上皮膜电阻抗（transepithelial electrical resistance，TER）下降，紧密连接复杂程度也有下降，包括紧密连接束数目减少和不连续、紧密连接网络深度下降等［2］。紧密连接的数目与TER呈对数关系，故TER是判断紧密连接屏障功能的主要指标。紧密连接束不连续是大分子（如食物抗原或细菌内毒素）穿透上皮屏障的关键原因。Oshitani等［3］研究显示，CD病变部位上皮膜蛋白中occludin、claudin-5和claudin-8表达均下调，而claudin-2表达却上调，且claudin-5和claudin-8可重新分布，到达紧密连接以外部位，失去其功能。同时研究显示［3］，CD非活动部位的紧密连接也受到破坏，跨膜蛋白occludin和胞质附着蛋白ZO家族可重新分布到细胞基底膜及固有层的细胞外基质中。

在UC中，病变肠管上皮屏障功能可下降80%以上，紧密连接束数目及网络深度也下降，但连续性却不受影响。UC病变肠管不论多形核细胞渗出是否活跃，均有急剧、广泛的occludin下调，其他紧密连接蛋白如ZO-1、JAM-A、claudin-1等在多形核细胞渗出活跃的部位下降，但在其他部位不受影响［4］。

3 炎性因子在紧密连接破坏中的作用

IBD中免疫反应异常一直被认为是发病的中心环节。当IBD发病时炎症破坏黏膜屏障，肠腔内抗原物质及病原菌向肠黏膜固有层移位并激活固有层免疫细胞，产生大量炎性细胞因子及介质，其炎性分子进一步加剧黏膜屏障损伤，肠上皮细胞紧密连接破坏导致细胞间隙通透性增加，细菌、内毒素及大分子物质就可通过紧密连接进入体循环［5］。

IBD发生时，炎性因子干扰素 γ（interferon-γ，IFN-γ）和肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）导致黏膜屏障破坏早有定论。

3.1 TNF与炎性肠病 众所周知，TNF是重要的免疫介质和促炎因子，研究认为TNF在IBD发病过程中免疫应答和持续具有不可缺少的作用。TNF-α可以增加肠上皮细胞旁的通透性，降低肠上皮细胞屏障的跨上皮电阻TER［6］。许多研究探讨了TNF-α调节紧密连接的可能机制，TNF-α能诱导上皮细胞核转录因子活化，活化的核因子κB、p50/p65亚基与肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MLCK）基因的启动子结合，启动MLCK转录，增加MLCK蛋白的表达［7］。Shen 等［8］发现，MLCK 促使肌球蛋白轻链磷酸化后，ZO-1和occludin及紧密连接周围骨架蛋白F-actin将重新分布，导致紧密连接破坏，增加通透性，但claudin-1和claudin-2受影响有限。TNF-α不仅能直接影响上皮细胞紧密连接蛋白表达及分布，并能与IFN-γ呈协同作用，诱导MLCK等紧密连接调节蛋白的表达。

3.2 IFN-γ与 IBD IFN-γ能够启动上皮细胞对TNF-α的反应，之后TNF-α通过上调MLCK和促使MLCK磷酸化破坏紧密连接。经IFN-γ预处理后细胞TNFR2表达增加是TNF-α发挥作用的关键因素，IFN-γ通过诱导TNFR2表达，激活肠上皮对 TNF-α产生反应［9］。这些研究提示，阻断TNFR2可能作为恢复重建肠道屏障的潜在靶点之一，对IBD有治疗作用［10］。同时研究显示，IFN-γ丝氨酸蛋白酶抑制剂4-（2-氨乙基）苯磺酰氟盐酸盐能通过改善断裂的claudin-2而使IFN-γ破坏的肠黏膜上皮屏障得以恢复［11］。在IBD发病早期，肠黏膜IFN-γ水平明显增高，并上调MLCK等紧密连接调节蛋白的表达，使紧密连接蛋白的表达下降，导致肠黏膜通透性增高［12］。

3.3 IL-13与IBD 白细胞介素（interleukin，IL）13是Th2类炎性因子。UC时主要由黏膜固有层单个核细胞产生，固有层细胞高表达IL-13。体外经IL-13的诱导，肠上皮细胞紧密连接蛋白claudin-2的表达也平行增高，claudin-2能诱导肠黏膜针对小分子物质的通透性增高，导致UC临床症状出现，如腹泻等。UC肠道claudin-2表达水平可达正常人10倍以上。因此，在UC发病中，IL-13水平增高可影响肠黏膜上皮细胞紧密连接蛋白的表达及分布。IBD炎性肠黏膜高表达的其他细胞因子，如IL-1B也能影响上皮细胞紧密连接蛋白表达及分布。IL-1B是肠道炎性反应级联放大反应环节的核心炎性因子。在生理剂量范围内IL-1B可引起人结肠癌上皮细胞TER下降，并呈剂量和时间效应［13］。进一步研究发现，IL-1B可使MLCK表达和活性增加，而MLCK表达增加可导致核因子κB活化，导致紧密连接破坏［14］。

肠道炎性反应是否由紧密连接损害直接启动?这些损害是否是肠道过度炎性反应和促炎因子破坏的后果?应用基因剔除或转基因小鼠模型，阐述紧密连接蛋白在IBD发病机制中的作用可能对解答这些疑问有一定帮助。葡聚糖硫酸钠诱导JAM-A缺失小鼠，试验组疾病活动度、便血和结肠挛缩程度均高于对照组，而体质量显著低于对照组。JAM-A是紧密连接蛋白的组分之一，小鼠JAM-A缺失后，结肠上皮通透性增加，上皮TER下降，而黏膜下中性粒细胞浸润增加，并有淋巴细胞滤泡集合趋势，类似IBD的表现［15］。有研究显示，小鼠occludin缺失后并无肠道通透性下降。这可能是因为occludin剔除后，某些与之功能类似的蛋白高度表达，从而弥补了occludin缺乏造成的肠屏障功能障碍。

CD患者的屏障功能障碍体现了病变过程的早期反应，其可能受到遗传因素的影响，并由环境因素，如肠腔内食物抗原或细菌所触发。对于肠屏障功能障碍在CD中的作用机制并不十分明确，有研究显示轻度或者暂时性的上皮紧密连接打开有助于调节性T细胞产生，阻止黏膜炎性反应［16］。

4 保护肠上皮屏障药物在IBD治疗中的作用

4.1 对细胞骨架的保护和治疗 n-3多不饱和脂肪酸对临床IBD的治疗价值已经得到肯定。其作用机制除免疫调节、减轻组织炎性反应外，还能起到保护上皮紧密连接的作用。n-3多不饱和脂肪酸能够降低IFN-γ和TNF-α诱导的体外上皮细胞TER下降、紧密连接形态破坏、以及occludin和ZO-1的再分布等。大鼠肠炎模型经n-3多不饱和脂肪酸处理后，紧密连接蛋白ZO-1、claudin-1、claudin-5和claudin-8的表达水平明显增加，超微结构也明显好转［17］。

4.2 肠上皮的修复 三叶肽可以促进生长因子和细胞因子对上皮的修复作用，在溃疡附近修复肠上皮［18］。谷氨酰胺是肠上皮细胞所特需的营养物质，体外Caco-2细胞，如剥夺谷氨酰胺、细胞occludin、claudin-1和ZO-1表达水平均下降，分布亦受影响，紧密连接复合体的数目、致密程度和复杂程度同时受到影响。实验显示，乙醛处理Caco-2细胞后，细胞旁通透性增加，occludin、ZO-1均重新分布，而给予L-谷氨酰胺则可逆转这一过程［19］。上皮特异性的生长因子也具有维护上皮紧密连接的作用。表皮生长因子能迅速降低坏死性小肠炎小鼠肠上皮通透性，使occludin和claudin-3表达水平恢复正常［20］。

4.3 对于紧密连接的修复和治疗 过度表达的TNFR-2介导TNF信号通路，触发上皮增加MLCK的表达及MLCK磷酸化，细胞紧密连接蛋白损伤和屏障功能丧失。这为修复肠屏障功能、阻止疾病发展过程中提供了一个新的途径［21］。

依那西普是重组的可溶性人TNFR蛋白，可竞争性地与s-TNF-α结合，阻断TNF-α与受体结合，降低TNF-α活性，干扰信号通路，从而达到治疗效果。虽然在IBD治疗中效果不确切，但从理论上这也为治疗IBD提供了新的思路［21］。

4.4 其他治疗方法 益生菌已被长期用于IBD的临床治疗。现发现其作用机制亦与调节上皮紧密连接有关。体外研究显示，益生菌 E.coli Nissle 1917（EcN）能够调节蛋白激酶C信号途径，并使紧密连接蛋白ZO-2表达增加和重新分布，逆转致病菌引起的肠上皮细胞紧密连接破坏［22］。

另外，目前开发的中草药和一些中成药对肠上皮细胞及细胞间紧密连接也具有一定的保护作用，而且不良反应相对较小。小檗碱（黄连素）是我国传统中药黄连的主要成分，临床上对各种微生物所致肠炎均有一定的疗效，同时小檗碱对肠黏膜屏障及紧密连接的功能可能也具有保护作用［23］。

5 小结

肠黏膜屏障有效地将肠腔内的抗原、细菌等有害物质与肠固有层的免疫组织相隔绝，避免激活肠固有层的免疫组织反应。这其中以肠上皮的紧密连接最为重要。IBD发病时，原发损害和继发损伤都破坏肠上皮间连接，有害物质侵入固有层，继发过度免疫反应。目前，除开发的中药以外，许多特异性的生长因子及激酶抑制剂可以有效减轻炎性反应，同时保护上皮连接，改善黏膜屏障，这些都将是IBD治疗的新目标。

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