以梭鱼金属硫蛋白基因表达监测海洋重金属污染

安立会,郑丙辉,付 青,赵兴茹,尚晶晶,张 雷 (中国环境科学研究院,环境基准与风险评估国家重点实验室,国家环境保护河口与海岸带重点实验室,北京 100012)

以梭鱼金属硫蛋白基因表达监测海洋重金属污染

安立会*,郑丙辉,付 青,赵兴茹,尚晶晶,张 雷 (中国环境科学研究院,环境基准与风险评估国家重点实验室,国家环境保护河口与海岸带重点实验室,北京 100012)

分离了梭鱼金属硫蛋白132个碱基对应44个氨基酸的部分基因序列,以此为基础建立了分析梭鱼金属硫蛋白基因表达的实时定量PCR方法,并用于分析渤海南戴河和大神堂近岸海域野生梭鱼金属硫蛋白基因的表达.结果表明,南戴河野生梭鱼金属硫蛋白基因的表达水平(雄鱼:0.012 ± 0.0064 copies/copy β-actin;雌鱼:0.0099 ± 0.0042 copies/copy β-actin)明显高于大神堂野生梭鱼的表达水平(雄鱼:0.0017± 0.0011 copies/copy β-actin;雌鱼:0.0014 ± 0.00095 copies/copy β-actin).该结果与两地野生梭鱼体内重金属残留水平相一致,提示梭鱼金属硫蛋白基因可作为监测海洋重金属污染的敏感标志物之一.

梭鱼；金属硫蛋白mRNA；实时定量PCR；重金属

金属硫蛋白是一种广泛存在于动物、植物以及微生物体内的低分子量、富含半胱氨酸的蛋白质.它能够与重金属结合,调节生物体内必需重金属(如锌和铜)的生理功能,并对非必需重金属(如镉和铅)进行脱毒.尽管生物体内金属硫蛋白的表达会受到多种因素的影响,但重金属仍然是其最强诱导剂.近年,金属硫蛋白作为监测水环境重金属污染的一个重要标志物,已经得到广泛关注

[1-4].随着分子生物学等新兴技术手段在环境领域的应用,不同生物的金属硫蛋白基因序列被相继克隆,这为从基因表达水平上更加及时、准确反映环境重金属的污染状况提供了可靠技术手段[5-10].目前用于分析金属硫蛋白基因表达水平的方法主要有Northern 杂交[11]、半定量聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)[12]和实时定量PCR[13],其中实时定量PCR被认为是灵敏度最高的一种分析方法[14-15].

梭鱼是我国海洋近岸广泛分布的一种野生鱼类,主要摄食浮游生物和底泥中的有机质,并且洄游半径短,体内的污染水平能够反映栖息环境的污染状况.本研究通过克隆梭鱼的金属硫蛋白基因序列,建立了分析金属硫蛋白的实时定量PCR分析方法,并对渤海近岸野生梭鱼体内金属硫蛋白基因表达水平和重金属水平进行了分析.

1 材料与方法

1.1 样品采集

利用潮汐水位差布设地撩网,在南戴河(39°43'31.03"N, 119°24'48.17"E)和 大 神 堂(39°10'41.66"N, 117°57'52.79"E)近岸海域捕获野生梭鱼(Liza Haematocheila)(图1).选取规格相似[南戴河站点:平均体重为(177.03 ± 45.84) g,平均体长为(25.5 ± 2.2)cm;大神堂站点:平均体重为(104.01 ± 76.89) g,平均体长为(20.1 ± 4.9) cm]、体表无伤、健康鲜活的梭鱼(样本数n ＞ 10),击打头部致昏.现场立即解剖摘取部分肝脏置于液氮中冻存以用于分析金属硫蛋白基因表达水平,剪取性腺置于10%中性甲醛中固定,以做组织切片,区分雌雄.同时取部分肌肉置于低温保温箱内带回实验室分析重金属.

图1 野生梭鱼捕获布设地示意Fig 1 Sampling sites for collecting the redeye mullets from Bohai Bay, north of China

1.2 实时定量PCR分析野生梭鱼金属硫蛋白基因

分取液氮冻存的梭鱼肝组织约20～30mg(每点雌雄各5尾),利用Trizol试剂提取总RNA[16].经紫外和电泳检测分析 RNA浓度和质量后(A260/280＞ 1.8),逆转录合成cDNA:取约100ng 的总 RNA, 0.5mmol/L dNTPs (Takara Ltd,大连),2.5µmol/L Oligo(dT)18(Invitrogen Ltd, USA)和200 units SuperScript III RT (Invitrogen Ltd, USA),反应体积为 5µL.一个管内不加样品 RNA以作为阴性对照.混合液按照SuperScript III RT试剂说明进行逆转录合成cDNA第一条链.

利用Bioedit 7.0.0软件比对NCBI数据库中已发表的其它生物金属硫蛋白基因序列(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov),利用 Primer Premier 5.0在保守序列部分设计兼并引物:Forward primer: 5’-CGGGATCCATGGA(c,t)CC(c,t)TG(c,t)GA(a, g,t)TGC(g,t)C(c,t)AA-3’, Reverse primer: 5’-GGAATTCTT(a,g)CACAC(a,g)CAGCC(a,t)CA(a,g) GC(a,g)CA-3’.以上述合成的cDNA第一链为模板,利用 MyCyclerTMPCR仪(BioRad, USA)在下列条件下扩增梭鱼金属硫蛋白基因:95℃,2min,1个循环;95℃,30s;55℃,45s,72℃,60s,40个循环;最后在72℃条件下延伸6min.反应总体积为50µL.所得扩增产物在 1.2%琼脂糖凝胶进行电泳和EB染色,在紫外照射条件下切下目的条带回收、纯化,送至大连宝生物公司测序.

利用 BLAST(hhtp://www.ncbi.nlm.nih.gov /BLAST/)在线比对所得序列.在证实所得序列即为金属硫蛋白基因序列后,利用 Primer Express 2.0软件设计实时定量PCR的特异引物(Forward primer: 5’-ATGGACCCTTGTGATTGC-3’;Reverse primer: 5’-CAGATGGGCAGCATGAGC-3’). PCR反应混合液包括SYBR Green PCR Master Mix 10μL,正向和反向引物各 0.2μL(20μmol/L),样品cNDA模板5μL,加灭菌的蒸馏水补足至20μL.扩增条件为:50℃保持 2min,95℃保持 10min,然后95℃,15s,60℃,1min,40循环(ABI Prism® 7000, USA).在最后1个循环结束后做溶解曲线验证引物的特异性.以纯化的金属硫蛋白普通PCR产物作为cDNA标准品建立定量标准曲线,以β-actin (No.EF638008)为内参基因对金属硫蛋白基因的表达水平进行定量.

1.3 野生梭鱼体内重金属分析

为了揭示诱导金属硫蛋白表达的可能诱导剂,同时分析了鱼体的重金属水平.取冻存的梭鱼部分肌肉组织(每点各10尾),去表皮和肌尖刺后置于超纯水(电导率:18.0Ω/cm)中高速匀浆,然后将所得肉糜冷冻干燥(-40℃)至恒重.精确称取0.1000g冻干的肌肉组织粉末,加入 5Ml HNO3(65.0%,CNW,德国)和 3mL HF(40%, MERCK,德国),轻轻震荡混匀后置于微波消解仪(MARS, CEM, USA)进行消解:温度在起始5min内上升至120℃并持续1min,然后在5min内上升至160℃并持续3min,最后在7min内上升至180℃并持续10min,然后静置至室温.消解液转移至聚四氟乙烯烧杯中,置于电热板上加热去除残酸.然后将样品液转移至 100mL的容量瓶中,用2% HNO3洗涤聚四氟乙烯杯3～4次,合并洗液定容、摇匀备用分析重金属元素.按同样的方法做试剂空白.利用 ICP-MS(Agilent 7500)测定消解样品中As、Cd、Cr、Mn、Ni、Cu、Pb和Zn,以Sc、Ge、Rh、In、Tb、Lu和Bi作为在线内标(Agilent Part Number: 5188-6525)进行定量.

最后,根据梭鱼体内重金属含量计算重金属残留量指数(I),采用均值型综合污染指数法[17]对两个地点野生梭鱼重金属污染状况进行了评价.

式中: Ci为鱼体内 i类重金属残留量,即实测值, mg/kg;Cs,i为 i类重金属允许残留量 mg/kg.其中,As、Cd、Cr、Cu和 Pb的评价标准按照 NY 5073-2001《无公害食品 水产品中有毒有害物质限量》[18](分别为0.5,0.1,2.0,50和0.5mg/kg)计算;Zn按照 GB13106-1991《食品中锌限量标准》[19](50mg/kg)计算;由于目前食品上还没有 Mn和 Ni的限量标准,因此 Mn和 Ni不计入.结合相关研究

[20-21],污染程度采样以下划分标准:污染综合指数均值＜0.2视为正常背景水平,0.2～＜0.6为轻污染水平,0.6～＜1.0污染水平,≥1.0则视为重污染水平.

1.4 数据处理

采用SPSS 11.0软件的One-way ANOVA 和Turkey 多重比较来检验相关数据的差异.当P ＜0.05 时认为差异显著.所有数据和图表均以平均值±标准偏差表示.

2 结果

2.1 梭鱼金属硫蛋白基因分离、测序与鉴定

图2 利用兼并引物扩增梭鱼金属硫蛋白基因部分序列Fig.2 Partial nucleotide and protein of the redeye mullet (Liza haematocheila) MT gene. The numbers above the sequence indicate the nucleotide position

利用设计的兼并引物,分离了梭鱼肝组织cDNA扩增后片段,经测序获得132个碱基,根据三联体密码子对应着 44个氨基酸(图 2).通过BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)在线比对确认为金属硫蛋白基因,将所得序列提交至NCBI数据库(No.: FJ827633).经与NCBI数据库登记的其他物种金属硫蛋白比对,本研究扩增的梭鱼金属硫蛋白基因属于 MT-I型,并与斑点鲑鱼(Oncorhynchus gorbuscha, ABA03251)和欧洲鲽 (Pleuronectes platessa, CAA40067)具有 86%相似性,与北极红点鲑(Salvelinus alpines, AAP31403) 具有 82%的相似性,与鲫鱼(Carassius auratus, AAB32777)具有79%的相似性(图3).

图3 梭鱼金属硫蛋白基因部分氨基酸序列与斑点鲑鱼(Oncorhynchus gorbuscha, ABA03251)、欧洲鲽(Pleuronectes platessa, CAA40067)、北极红点鲑(Salvelinus alpines, AAP31403)、鲫鱼(Carassius auratus, AAB32777)氨基酸序列比对Fig.3 Multiple sequence alignment of the partial amino acid sequence of redeye mullet MT with Oncorhynchus gorbuscha (ABA03251), Salvelinus alpinus (AAP31403), Pleuronectes platessa (CAA40067) and Carassius auratus (AAB32777)

2.2 梭鱼金属硫蛋白实时定量PCR建立与应用

根据测序所得目标基因序列设计特异引物,经溶解曲线证实设计引物的特异性.以金属硫蛋白普通 PCR产物做标准品建立定量曲线,cDNA浓度范围在104～1010copies/mL之间时拷贝数与 Ct值之间具有良好的线性关系(R2= 0.999).

图4 实时定量PCR分析南戴河和大神堂野生梭鱼肝组织中金属硫蛋白表达水平Fig.4 Quantification of MT mRNA in redeye mullet (Liza haematocheila) from Nandaihe and Dashentang

将建立的金属硫蛋白实时定量PCR方法对野生梭鱼肝组织中金属硫蛋白的表达水平进行定量.如图4可知,南戴河野生梭鱼体内金属硫蛋白的表达水平(雄鱼 n = 5:0.012±0.0064 copies/ copy β-actin,雌鱼 n = 5:0.0099 ± 0.0042 copies/ copy β-actin)明显高于大神堂野生梭鱼的表达水平(雄鱼 n = 5:0.0017±0.0011 copies/copy β-actin,雌鱼 n = 5:0.0014 ± 0.00095 copies/copy β-actin) (P ＜ 0.05).并且同一地点的雌雄梭鱼肝组织中金属硫蛋白表达水平没有显著差异(P ＞ 0.05).

2.3 野生梭鱼体内重金属水平分析

在南戴河和大神堂捕获的野生梭鱼体内均检测到多种重金属元素(表1).其中,Zn的含量最高,Pb含量最低.在所检出梭鱼体内的重金属中,只有Pb的浓度是大神堂高于南戴河,其他重金属均是南戴河较大神堂略高,而 Cd在两处野生梭鱼肌肉中均没有检出.与底栖虾虎鱼[22]相比,梭鱼体内重金属水平均偏低,这可能与梭鱼是中上层、主要以浮游生物为食的杂食性鱼类,而虾虎鱼则是底栖、主要以动物食物为主的肉食性鱼类有关[23].由表 1数据以及梭鱼肌肉含水率(81.62%±1.85%),换算可得野生梭鱼体内重金属含量(湿重).根据国家无公害食品水产品中有毒有害物质限量NY5073-2001[18],南戴河野生梭鱼[Cr(2.19±0.19)mg/kg(湿重)]和 As含量[(1.83%± 0.06%)mg/kg(湿重)]明显超标,而大神堂野生梭鱼重金属则没有超标现象,这说明该水域野生梭鱼重金属污染对食用人群具有潜在风险.

根据梭鱼体内重金属含量(干重)和梭鱼肌肉含水率(81.62%±1.85%),计算南戴河和大神堂两地野生梭鱼各种重金属的鱼体残留量指数(I),并取其均值作为综合污染指数(表 2),用于评价各种重金属对梭鱼的综合污染程度.根据评价标准,南戴河的综合污染指数均值为 3.93,属于污染水平,主要贡献因此为Cr(1.09)和As(3.70);而大神堂的综合污染指数均值为 0.29,属于轻污染水平,这与两地野生梭鱼金属硫蛋白基因表达水平一致.

表1 野生梭鱼体内重金属元素含量[μg/g(干重)]Table 1 Heavy metals concentrations in tissues in redeye mullets from Nandaihe and Dashentang using ICP-MS [μg/g(dry weight)]

表2 野生梭鱼体内重金属残留量指数与均值综合污染指数Table 2 Heavy metals residue index and mean of synthetical pollution index in redeye mullets from Nandaihe and Dashentang

研究发现,除了蝶科鱼类(Pleuronectid fishes)[24-25],大多数鱼类金属硫蛋白都有 I和 II两种亚型,对应MT-I和MT-II两种基因亚型.并且,不同金属硫蛋白亚型对不同重金属有着不同的结合能力[26-27],如MT-I对Zn和Cd具有很强的结合能力,MT-II则对 Cu具有很强的结合能力

[28].野外调查也发现在一些野生鱼类体内金属硫蛋白的水平与重金属水平尤其是 Cd、Zn和Cu三种重金属污染程度呈一定的相关性[29-31].本研究在南戴河和大神堂梭鱼肌肉组织中都有检出了Zn和Cu,表明Zn和Cu尤其是Zn对本研究扩增的梭鱼金属硫蛋白基因(MT-I)表达具有一定的诱导作用.本研究中在两地野生梭鱼肌肉组织中均没有检出Cd,这可能是由于Cd在环境非生物介质中含量较低[32],并且鱼类通过鳃和肠摄入 Cd后主要累积在肝和肾脏组织[33],只有少量重金属会转移到肌肉组织,但由于 Cd对鱼类 MT-I要比对 MT-II具有更强的诱导能力

[1,34-35],因此环境低水平的Cd以及其他重金属也会对梭鱼肝组织金属硫蛋白基因(MT-I)具有一定的诱导作用.

在生物体内,重金属水平与金属硫蛋白的蛋白和基因表达水平之间存在典型的倒“U”型关系[36-38],即当重金属低于某一浓度阈值时,金属硫蛋白会随着重金属剂量增加而上升;而一旦超出浓度阈值,重金属就会对生物产生不可逆毒性,金属硫蛋白水平就会随着重金属水平增加而降低.从以上分析结果可以看出,尽管南戴河和大神堂野生梭鱼体内重金属化学水平没有显著差异,但南戴河野生梭鱼肝组织金属硫蛋白基因表达水平却明显高于大神堂的野生梭鱼.如果以大神堂海域重金属水平为对照值,两地野生梭鱼体内重金属残留水平无显著差异,但金属硫蛋白基因表达水平的差异说明南戴河海域重金属污染已经对野生梭鱼产生轻微影响,但没有超出可产生生物毒性的浓度阈值,这就说明化学水平上的不显著差异无法准确反映污染的综合效应差异.另外,环境中重金属对生物的影响还会受到多种环境因子如温度、盐度、硬度和生物因子如个体大小、年龄、生理状态的影响,重金属的不同形态和价态也会影响重金属的生物毒性.因此,仅凭环境重金属的化学水平还难以准确反映重金属的实际毒理效应,而金属硫蛋白作为一个生物标志物在一定程度上可以用于指示环境中重金属污染的复合效应.

3 结语

本研究发现野生梭鱼金属硫蛋白的基因表达水平更能反映南戴河附近海域重金属污染程度高于大神堂附近海域,提示梭鱼金属硫蛋白基因可作为监测海洋重金属污染的敏感标志物之一.

[1] Quirós L, Pinã B, Solé M, et al. Environmental monitoring by gene expression biomarkers in barbus graellsii: laboratory and field studies [J]. Chemosphere, 2007,67:1144-1154.

[2] Chan K M. Concentrations of copper, zinc, cadmium, and lead in Rabbit fish (Siganus oramin) collected in Victoria Harbour, Hong Kong [J]. Mar. Pollut. Bull., 1995,31(4-12):411-415.

[3] Nikpour Y, Zolgharnein H, Sinaei M, et al. Evaluation of Metallothionein Expression as a Biomarker of Mercury Exposure in Scatophagus argus [J]. Pak. J. Biol. Sci., 2008,11:2269-2273. [4] Pederson S N, Lundebye A K, Depledge M H. Field application of metallothionein and stress protein biomarkers in the shore crab (Carcinus maenas) exposed to trace metals [J]. Aquat. Toxicol., 1997,37:183-200.

[5] Tom M, Moran O, Jakubov E, et al. Molecular characterization of metallothionein-cDNA of Sparus aurata used for detecting heavy metal pollution along the Mediterranean coast of Israel [J]. Mar. Pollut. Bull., 1998,36:131-137.

[6] Hylland K, Nissen-Lie T, Christensen P G, et al. Natural modulation of hepatic metallothionein and cytochrome P4501A in flounder, Platichthys flesus L. [J]. Mar. Environ. Res., 1998,46: 51-55.

[7] Mitsuo R, Itakura T, Sato M. Cloning and Sequencing of Cytochrome P450 1A Complementary DNA in Eel (Anguilla japonica) [J]. Mar. Biotechnol., 1999,1:353-358.

[8] Ren H W, Itoh N, Kanekiyo M. Two metallothioneins in the fresh-water fish, crucian carp (Carassius cuvieri): cDNA cloning and assignment of their expression isoforms [J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2000,23:145-148.

[9] Ryu J, Lee M S, Na J G, et al. Molecular cloning of cytochrome P4501A cDNA of medaka (Oryzias latipes) and messenger ribonucleic acid regulation by environmental pollutants [J]. Environ. Toxicol. Chem., 2004,23:1004-1011.

[10] Kim C I, Kim Y J, Yoon Y D, et al. Cloning of cytochrome P450 1A (CYP1A) genes from the hermaphrodite fish Rivulus marmoratus and the Japanese medaka Oryzias latipes [J]. Mar. Environ. Res., 2004,58:125-129.

[11] Carginale V, Scudeiro R, Capasso C, et al. Cadmium-induced differential accumulation of metallothionein isoforms in the Antarctic icefish,which exhibits no basal metallothionein protein but high endogenous mRNA levels [J]. Biochem. J., 1998,332: 475-481.

[12] Hayes R A, Regondi S, Winter M J, et al. Cloning of a chub metallothionein cDNA and development of competitive RT-PCR of chub metallothionein mRNA as a potential biomarker of heavy metal exposure [J]. Mar. Environ. Res., 2004,58: 665-669.

[13] Werner J, Palace V, Baron C, et al. A real-time PCR method for the quantification of the two isoforms of metallothionein in Lake Trout (Salvelinus namaycush) [J]. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 2008,54:84-91.

[14] Kaplan L A E, Van Cleef K, Wirgin I, et al. A comparison of RT-PCR and Northern blot analysis in quantifying metallothionein mRNA levels in killifish exposed to waterborne cadmium [J]. Mar. Environ. Res., 1995, 39:137-141.

[15] Evans C W, Wilson D A, Mills G N. Quantitative competitive RT-PCR as a tool in biomarker analysis [J]. Biomarkers, 2001, 6(1):7-14.

[16] An L H, Hu J Y, Zhang Z B, et al. Quantitative real-time RT-PCR for determination of vitellogenin mRNA in so-iuy mullet (Mugil soiuy) [J]. Anal. Bioanal. Chem., 2006,386:1995-2001.

[17] 杨婉玲,赖子尼,魏泰莉,等.北江清远段水产品中铅含量调查[J]. 淡水渔业, 2007,37(3):67-69.

[18] NY 5073-2001 无公害食品 水产品中有毒有害物质限量[S].

[19] GB 13106-1991 食品中锌限量标准 [S].

[20] 贾晓平,林 钦,李纯厚,等.广东沿海牡蛎体Pb含量水平及时空变化趋势 [J]. 水产学报, 2000,24 (6):527-532.

[21] 魏泰莉,杨婉玲,赖子尼,等.珠江口水域鱼虾类重金属残留的调查 [J]. 中国水产科学, 2002,9(2):172-176.

[22] 安立会,郑丙辉,张 雷,等.渤海湾河口沉积物重金属污染及潜在生态风险评价 [J]. 中国环境科学, 2010,30(5):666-670.

[23] Culioli J L, Fouquoire A, Calendini S, et al. Trophic transfer of arsenic and antimony in a freshwater ecosystem: A field study [J]. Aquatic Toxicology, 2009,94:286-293.

[24] George S G, Todd K, Wright J. Regulation of metallothionein in telesosts: induction of MT mRNA and protein by cadmium in hepatic and extrahepatic tissues of marine flatfish, the turbot (Scophthalmus maximus) [J]. Comp. Biochem. Physiol. C, 1996,113:109-115.

[25] George S G, Gubbins M, MacIntosh A, et al. A comparison of pollutant biomarker responses with transcriptional responses in European flounders (Platicthys flesus) subjected to estuarine pollution [J]. Mar. Environ. Res., 2004,58:571-575.

[26] Vasconcelos M H, Tam S C, Beattie J H, et al. Evidence for differences in the post-transcriptional regulation of rat metallothionein isoforms [J]. Biochem. J., 1996,315:665-671.

[27] Kawata T, Nakamura S, Nakayama A, et al. An improved diagnostic method for chronic hepatic disorder: analysis of metallothionein isoforms and trace metals in the liver of patients with hepatocellular carcinoma and determined by capillary zone electrophoresis and inductively coupled plasma-mass spectrometry [J]. Biol. Pharm. Bull., 2006,29:403-409.

[28] Zafarullah M, Olsson P E, Gedamu L.Differential regulation of metallothionein genes in rainbow trout fibroblasts, RTG-2 [J]. Biochem Biophys Acta, 1990,1049:318-323.

[29] Hamza-Chaffai A, Amiard J C, Pellerin J, et al. The potential use of metallothionein in the clam Ruditapes decussatus as a biomarker of in situ metal exposure [J]. Comp. Biochem. Physiol., 2000,127:185-197.

[30] Roch M, McCarter J A, Matheson M, et al. Hepatic Metallothionein in Rainbow Trout (Salmo gairdneri) as an Indicator of Metal Pollution in the Campbell River System [J]. Can. J. Fish. Aquat. Sci., 1982,39:1596-1601.

[31] Wong C K, Yeung H Y, Cheung R Y, et al. Ecotoxicological assessment of persistent organic and heavy metal contamination in Hong Kong coastal sediment [J]. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 2000,38:486-493.

[32] 毛天宇,戴明新,彭士涛,等.近 10年渤海湾重金属(Cu, Zn, Pb, Cd, Hg)污染时空变化趋势分析 [J]. 天津大学学报, 2009, 42(9):817-825.

[33] Hogstrand C, Haux C. Binding and detoxification of heavy metals in lower vertebrates with reference to metallothionein [J]. Comp. Biochem. Physiol., 1911,100:137-141.

[34] Hermesz E, Ábrahám M, Nemcsók J. Tissue-specific expression of two metallothionein genes in common carp during cadmium exposure and temperature shock [J]. Biochem. Physiol. Part C, 2001,128: 457-465.

[35] Chan P, Shiu C, Wong F, et al. Common carp metallothionein gene: cDNA cloning, gene structure and expression studies [J]. Biochim. Biophys. Acta, 2004,1676:162-171.

[36] Wu S M, Jong K J, Lee Y J. Relationships among metallothionein, cadmium accumulation, and cadmium tolerance in three species of fish [J]. Bull. Environ. Contam. Toxicol., 2006,76:595-600.

[37] Olsson P E, Larsson A, Mage A, et al. Induction of metallothionein synthesis in rainbow trout, Salmo gairdneri, during long-term exposure to water-borne cadmium [J]. Fish. Physiol. Biochem., 1989,6:221-229.

[38] Cheung A P L, Lam T H-J, Chan K M. Regulation of Tilapia metallothionein gene expression by heavy metal ions [J]. Marine Environmental Research, 2004,58:389-394.

Metallothionein mRNA expression in wild redeye mullet (Liza Haematocheila) for monitoring marine heavy metal pollution.

AN Li-hui*, ZHENG Bing-hui, FU Qing, ZHAO Xing-ru, SHANG Jing-jing, ZHANG Lei (State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment, State Environmental Protection Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research, Chinese Research Academy for Environment Sciences, Beijing 100012, China). China Environmental Science, 2011,31(8)：1383～1389

In this study, a 132-bp sequence corresponding to a 44-amino acid sequence of metallothionein gene was obtained, and then a quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay was developed for quantification of MT mRNA normalized to β-actin in redeye mullets. The method was applied to detect MT mRNA expression in redeye mullets from Nandaihe and Dashentang in Bohai Bay, and the results showed that MT mRNA expression in redeye mullets was higher significantly from Nandaihe (0.012 ± 0.0064 copies/copy β-actin in males and 0.0099 ± 0.0042 copies/copy β-actin in females) than that from Dashentang (0.0017 ± 0.0011 copies/copy β-actin in males and 0.0014 ± 0.00095 copies/copy β-actin in females) which was consistent with the heavy metals concentrations, indicating that MT mRNA can be a promising biomarker for monitoring metals pollutions in coastal environment.

redeye mullet (Liza Haematocheila)；metallothionein mRNA；quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction；heavy metal

X174

A

1000-6923(2011)08-1383-07

2010-11-17

国家“973”项目(2007CB407306);水体污染控制与治理技术重大专项 (2009ZX07528-03);中国新型环境问题(2009467109)

* 责任作者, 副研究员, anlh@craes.org.cn

安立会(1975-),男,河北廊坊人,副研究员,博士,主要从事环境有害污染物的生物毒理效应和生态风险评价研究.发表论文20余篇.