中国汉族人群中RELN基因rs7341475位点与精神分裂症的相关性分析

刘兴彦, 李 明, 杨顺英, 宿 兵, 尹利德,

(1. 玉溪市第二人民医院, 玉溪 653101; 2. 中国科学院昆明动物研究所 遗传资源与进化国家重点实验室, 昆明 650223; 3. 中国科学院研究生院, 北京 100049）

中国汉族人群中RELN基因rs7341475位点与精神分裂症的相关性分析

刘兴彦1, 李 明2,3, 杨顺英1, 宿 兵2,*, 尹利德1,*

(1. 玉溪市第二人民医院, 玉溪 653101; 2. 中国科学院昆明动物研究所 遗传资源与进化国家重点实验室, 昆明 650223; 3. 中国科学院研究生院, 北京 100049）

精神分裂症是一种常见的复杂精神疾病。大量的实验证据表明, 遗传因素在精神分裂症的发生中起到了重要的作用。截至目前, 有报道称至少 100个基因与精神分裂症相关, 但它们在不同人群中的重复性不好。在这些基因中,RELN在多个人群中都被证实与精神分裂症相关, 表明它可能是一个真实的易感基因。目前, 在RELN基因上有很多个单核苷酸多态性位点被证实与精神分裂症相关, 其中研究最多的是通过全基因组关联分析发现的在RELN基因第四个内含子中的单核苷酸多态性位点 rs7341475, 它被证明与精神分裂症的发生相关。为了验证该位点在中国人群中是否与精神分裂症相关, 作者对来自中国玉溪的病例——对照样本(400位患者和400位正常人)进行了遗传分析。结果显示, 在该样本中rs7341475与精神分裂症不相关, 这表明rs7341475在中国人群中可能不是致病多态性位点。

精神分裂症;RELN; 单核苷酸多态性位点; 中国人群

精神分裂症是以基本个性的改变, 思维、情感、行为的分裂以及精神活动与环境的不协调为主要特征的一类最常见的精神疾病 (Andreasen, 1995)。流行病学调查表明, 精神分裂症在不同人群中的流行率相近, 都约为1% (Freedman, 2003)。精神分裂症的病因到目前仍不清楚, 但已有的数据表明, 遗传因素和环境因素都起作用。家系、双胞胎和领养研究证明, 精神分裂症具有很强的遗传倾向, 其遗传力可达80%～85% (Lichtenstein et al, 2009)。即使精神分裂症有如此高的遗传倾向, 对于探索它的易感基因的努力却收获很小。截至目前, 至少有100个基因被报道与精神分裂症相关, 却只有少数几种基因能持续在世界上不同人群中印证相关性, 包括DISC1、COMT、BDNF和NRG1等 (Georgieva et al, 2008; Hennah et al, 2009; Neves-Pereira et al, 2005; Shifman et al, 2002)。此外, 在探索精神分裂症的易感基因中, 全基因组关联分析被证明是成功的, 通过这种手段报道了数个新的精神分裂症易感基因，包括ZNF804A、TCF4、NRGN和MHC区域等(O'Donovan et al, 2008; Purcell et al, 2009; Shi et al, 2009; Stefansson et al, 2009)。

在早期的研究中, 通过全基因组连锁分析的方法在染色体7q22位置上发现精神分裂症易感的短重复序列, 而这些短重复序列正位于RELN基因内 (Ekelund et al, 2000; Wedenoja et al, 2008)。与此同时,RELN在精神分裂症患者脑中表达量出现了下降 (Eastwood & Harrison, 2006; Fatemi et al, 2000; Guidotti et al, 2000; Impagnatiello et al, 1998), 表明RELN基因可能参与了精神分裂症的发生。随后, 在欧洲人群中发现了多个RELN基因上的单核苷酸多态性位点与精神分裂症相关(Kahler et al, 2008), 并寻找出了其他位点与精神分裂症的表型显著相关 (Wedenoja et al, 2008, 2010)。因此, 这些都表明了RELN基因与精神分裂症的发生相关, 但是真正的致病多态性位点并没有被发现。

Shifman et al（2008)用全基因组关联分析的方法, 发现RELN基因第四个内含子中的单核苷酸多态性位点(rs7341475)在犹太女性人群及英国女性人群中与精神分裂症显著相关。随后, 这个位点(rs7341475)在另一份犹太人样本中也被证实与精神分裂症相关 (Liu et al, 2010; Pisante et al, 2009); 但这个位点在其他人群中则并不与精神分裂症相关(Need et al, 2009)。这些都表明rs7341475与精神分裂症相关, 但存在种族异质性。为了研究RELN基因的这个位点(rs7341475)在中国人群中是否与精神分裂症相关, 我们对一组来自中国云南省玉溪市的精神分裂症病例——对照样本(400位患者和400位正常人)进行了遗传关联分析。

1 材料和方法

1.1 样本

在云南省玉溪市第二人民医院收集了400位精神分裂症患者的血液, 包括227位女性和173位男性。这些患者经过至少两位精神病医生鉴定诊断,并且符合 ICD-10标准。患有酒精依赖精神障碍、头部损伤、有吸毒经历或者癫痫等其他精神疾病的患者均被排除。同时, 在云南当地收集了400位正常人的血液, 包括208位女性和192位男性。这些正常人及其家属都没有精神分裂症或者其他精神疾病的记录。所有的样本均为汉族, 所有的个体均提供了知情同意书。

1.2 基因分型

用标准的酚-氯仿的方法提取志愿者血样的基因组 DNA, 提取的 DNA样本随机分布在PCR板里。通过聚合酶链式反应(PCR)对含有目的位点的片段进行扩增。目的片段的正向引物是 5'-ACTGCAATAGAGGGGTACAGATT-3',反向引物是 5'-CTTCCTTGGTGCTTATACAAAG A-3', 反应条件为预变性95 ℃, 5 min, 变性95 ℃, 30 s, 退火58 ℃, 30 s, 延伸72 ℃, 40 s, 共45个循环,延伸72 ℃, 10 min。PCR反应体系为25 μL, 包含20 ng基因组 DNA。用外切酶和虾碱酶处理所得到的PCR产物, 以除去多余的dNTP和DNA单链碱基, 随后在 rs7341475位点 5'端上游设计引物 5'-TTTTT TCCCTATTTTACAGATGAGAGAATTGAGACTCAAA-3'并进行单碱基延伸反应(SNaPShot)。SNaPShot的产物在 ABI3130分析仪上进行基因分型, 随后通过GeneMapper 4.0软件自动读取基因分型结果, 并人工检查校正。我们随后随机抽取了 50个个体进行测序, 没有发现分型错误的个体。 基因分型成功率为100%。

1.3 统计分析

哈迪温伯格平衡检验采用 Haploview软件完成 (Barrett et al, 2005)。对于病例-对照样本遗传分析, 用PLINK软件进行单核苷酸位点与疾病的相关性分析。同时, 以性别作为协变量, 分别检测了这个位点在男性和女性中与精神分裂症的相关性(Purcell et al, 2007)。优势比(odds ratio)和95%的可信区间在网页上计算(http://faculty.vassa r.edu/lowry/odds2x2.html)。

2 结 果

2.1 SNP特征和哈迪温伯格平衡检验

在遗传分析的病例组和对照组中分别进行的哈迪温伯格平衡检验结果显示单核苷酸多态性位点未偏离哈迪温伯格平衡。这个多态性位点的基因型频率和基本信息见表1。

2.2 相关性分析

单位点分析结果见表 2。统计结果显示, rs7341475位点中低频基因型在精神分裂症人群中的出现频率与正常人群无显著性差异（P=0.9273）,表明在本组病例样本中, 该位点与精神分裂症不相关。为了检测是否存在性别特异的相关性, 我们将男性样本和女性样本分别进行统计, 分析发现无论男性还是女性, rs7341475都不与精神分裂症相关。

表1 SNP rs7341475 的特征及等位基因频率Tab. 1 Characteristics and allele frequencies of SNP rs7341475

表2 SNP rs7341475与精神分裂症的相关性分析的P值Tab. 2 P values of the association tests of SNP rs7341475 with schizophrenia

3 讨 论

RELN基因在胎儿或者成年人脑中表达(DeSilva et al, 1997), 主要参与神经元迁移和定位(Tissir & Goffinet, 2003)。RELN基因与多种精神疾病发生相关, 包括精神分裂症、双向情感障碍和老年痴呆症等(Goes et al, 2009; Seripa et al, 2008; Shifman et al, 2008);RELN在这些精神疾病患者的脑中表达异常 (Fatemi et al, 2000; Guidotti et al, 2000)。这些数据表明,RELN在神经发育系统起着很重要的作用, 但是对于它如何影响精神疾病的发生, 目前还没有明确的解释。

我们在中国人群中检测了rs7341475与精神分裂症的相关性, 但是发现该位点不与精神分裂症显著相关, 这表明在中国人群中 rs7341475可能并不是精神分裂症的易感位点。值得注意的是, 虽然有报道 rs7341475与精神分裂症相关, 但是同样也有很多研究小组发现 rs7341475与精神分裂症并不相关 (Need et al, 2009)。在最近的一次荟萃分析(meta analysis)中, Ben-David & Shifman (2010)将所有研究过rs7341475的样本综合起来后发现, rs7341475与精神分裂症的相关显著性并没有最初GWAS发现的强,并且如果除去最初的 GWAS研究, 发现 rs7341475与精神分裂症并不相关。这表明, 由于种族异质, 如遗传结构、环境因素、饮食和风俗的差异, rs7341475可能只在某个种族(如犹太人)中与精神分裂症相关,而在其他民族中并不与精神分裂症相关。当然, 我们也不能排除 rs7341475并不是精神分裂症易感位点的可能, 因为Tost et al(2010)研究发现, rs7341475并不能影响 RELN基因在脑中的表达, 同时也不能影响大脑的功能和结构。

越来越多的研究表明,RELN是一个真实的精神分裂症易感基因, 但是本研究表明, rs7341475可能并不是中国人群的致病多态性位点(不排除样本量偏小的因素)。此外, 虽然rs7341475与精神分裂症不相关, 但有可能在RELN基因的其他位置上有精神分裂症的易感位点。后续研究中, 我们将要加大样本量和增加所研究的多态性位点, 这样可能会找到RELN基因的真正致病位点。

致谢：感谢为本研究的开展提供DNA样本的志愿者。感谢中国科学院昆明动物研究所遗传资源与进化国家重点实验的张慧和李燕皎在实验方面的技术支持。

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Association ofRELNSNP rs7341475 with schizophrenia in the Chinese population

LIU Xing-Yan1, LI Ming2,3, YANG Shun-Ying1, SU Bing2,*, YIN Li-De1,*

(1.The Second People's Hospital of Yuxi City,Yuxi653101, China; 2.State Key Laboratory of Genetic Resources and Evolution,Kunming Institute of Zoology and Kunming Primate Research Center,the Chinese Academy of Sciences,Kunming650223,China; 3.Graduate School of Chinese Academy of Sciences, Beijing100101,China)

Schizophrenia is a common and complex psychiatric disorder. Significant evidence has suggested that genetic factors play pivotal roles in the etiology of schizophrenia. More than 100 schizophrenia candidate genes have been reported; however, many of them do not have satisfactory replications among different populations. Among these genes,RELNis thought to be associated with schizophrenia in many populations, suggesting it is a real risk gene for this disorder. Identified in the GWAS study, single nucleotide polymorphism (SNP) rs7341475, located in intron 4 ofRELN, has been successfully replicated in subsequent investigations, implying its potential contribution to schizophrenia susceptibility. To investigate the association of rs7341475 with schizophrenia in Chinese populations, a case-control association analysis was conducted with samples from Yuxi (400 cases and 400 controls) in southwestern China. The results do not indicate any association of rs7341475 with schizophrenia, which suggests it is not a risk SNP for schizophrenia in Han Chinese.

Schizophrenia;RELN; Single nucleotide polymorphism; Chinese population

Q987.2; Q593.2; R749.3

A

0254-5853-(2011)05-0499-05

10.3724/SP.J.1141.2011.05499

2011-03-29; 接受日期：2011-07-13

∗通讯作者(Corresponding authors)，E-mail: sub@mail.kiz.ac.cn; yxyinlide@gmail.com

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