含磷酸结合口袋的BRCT结构域功能位点预测

盛自章, 黄京飞

( 1. 中国科学院昆明动物研究所 遗传资源与进化国家重点实验室, 云南 昆明 650223; 2. 中国科学院研究生院, 北京 100049; 3. 中国科学院昆明动物研究所和香港中文大学生物多样性和人类疾病模型联合研究中心, 云南 昆明 650223)

含磷酸结合口袋的BRCT结构域功能位点预测

盛自章1,2, 黄京飞1,3,*

( 1. 中国科学院昆明动物研究所 遗传资源与进化国家重点实验室, 云南 昆明 650223; 2. 中国科学院研究生院, 北京 100049; 3. 中国科学院昆明动物研究所和香港中文大学生物多样性和人类疾病模型联合研究中心, 云南 昆明 650223)

BRCT( BRCA1 C-terminus)是真核生物DNA损伤修复系统重要的信号传导和蛋白靶向结构域。为了探讨含磷酸结合口袋的BRCT与磷酸化配体结合的机制, 对XRCC1 BRCT1、PTIP BRCT4、ECT2 BRCT1和 TopBP1 BRCT1进行了结构保守性和表面静电势分析。结果显示, 4个BRCT的磷酸结合口袋周围所存在的结构保守并带正电势的沟槽很可能是其功能位点, 并且类似的沟槽在含磷酸结合口袋的BRCT中普遍存在。沟槽两侧及底部均带有极性氨基酸残基, 两侧带正电荷, 而底部疏水。这说明沟槽与配体的结合以静电和疏水相互作用为主。沟槽主要位于单个BRCT中，而且4个BRCT的沟槽在形状和电荷分布上都不同, 说确明BRCT配体特异性主要由单个BRCT决定。磷酸结合口袋位于沟槽中心, 说明沟槽可能同时结合磷酸化残基的N端和C端附近残基。

BRCT结构域；磷酸结合口袋；DNA损伤修复；表面静电势

BRCT(BRCA1 C-terminus)结构域最早发现于乳腺癌相关蛋白 BRCA1中, 后来发现它还广泛存在于真核生物的DNA损伤修复蛋白中(Bork et al, 1997)。BRCT结构域能够识别被DNA损伤探测蛋白如 ATM (ataxia telangiectasia mutated protein)或ATR(ATM-Rad3-related kinase)磷酸化修饰的蛋白,并将DNA损伤的信号传导给下游分子; 也可以通过与非磷酸化的蛋白相互作用将修复蛋白靶向到DNA损伤位点(Dulic et al, 2001; Mohammad & Yaffe, 2009; Glover et al, 2004)。BRCT结构域包含约95个氨基酸残基, 其二级结构主要由3个α-螺旋围绕4个平行的β-片层组成(β1-α1-β2-β3-α2-β4-α3, α1-和α3-螺旋位于β-片层的一侧, α2-螺旋则位于另一侧)(Zhang et al, 1998)。在DNA连接酶III和XRCC1(X-ray repair cross complementing protein 1)等蛋白中, BRCT结构域以单体形式存在并发挥功能(Dulic et al, 2001)。在BRCA1 和 MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint 1)等蛋白中, BRCT结构域则由序列上相隔20～30个氨基酸残基的两个BRCT组成二联体。根据两个 BRCT相互作用方式的不同可将其分为 I类和 II类二联体(Sheng et al, 2011; Rappas et al, 2011)：I类二联体的两个 BRCT通过 N 端BRCT(BRCTa)的α2-螺旋与C端BRCT(BRCTb)的α1-和α3-螺旋形成三螺旋束的形式结合, 两个BRCT的β-片层相互平行, 如BRCA1和MDC1中的二联体(Williams et al, 2001, Glover et al, 2004); II类二联体的两个BRCT可能通过BRCTa的α2-螺旋与BRCTb的β-片层底部结合, 两个BRCT的β-片层相互垂直,如 PTIP (PAX transcription activation domain interacting protein 1)BRCT1-2和BRCT3-4, TopBP1 BRCT4-5 (Rappas et al, 2011; Sheng et al, 2011)。在TopBP1 (topoisomerase (DNA) II binding protein 1)和Ect2 (epithelial cell transforming sequence 2)的N端, BRCT结构域由序列上相隔～20个氨基酸残基的三个BRCT组成(TopBP1 BRCT0、BRCT1和BRCT2)(三联体), 相邻的两个BRCT也是以β-片层相互垂直的方向相互结合(Rappas et al, 2011; Sheng et al, 2011)。

研究表明, 很多 BRCT结构域均含有由位于β1- C端邻接的Ser和Gly, α1- N端的Arg和α2- N端的Lys组成的磷酸结合口袋(Williams et al, 2004)。磷酸结合口袋与这些BRCT的功能紧密相关, 例如, RFC1(replication factor C large subunit)中的单体BRCT可以结合DNA末端的磷酸(Kobayashi et al, 2010)。但研究最清楚的是I类二联体识别特异磷酸化蛋白的机制。磷酸化蛋白识别口袋由 BRCTa的磷酸结合口袋延伸至BRCTa与BRCTb相互作用的三螺旋束区。BRCTa的磷酸结合口袋结合磷酸丝氨酸(磷酸丝氨酸结合区), 而三螺旋束区结合磷酸丝氨酸 C端第一到第三位的残基(特异性决定区)(Williams et al, 2004)。此外, 磷酸结合口袋还存在于一些参与蛋白内或蛋白间相互作用的单体、II类二联体和三联体的BRCT中。由于这三类BRCT与I类二联体结构上的差异, 而且II类二联体的磷酸结合口袋位于BRCTb而不是BRCTa, 它们并不含有I类二联体的决定识别特异性的三螺旋束区。研究表明这三类 BRCT也可以结合含有磷酸基的配体(Yu et al, 2003; Rappas et al, 2011; Masson et al, 1998; Munoz et al, 2007; Kim et al, 2005), 但具体机制不清楚。因此, 本研究对这三类BRCT进行了结构保守性和表面静电势分析, 并对其结合磷酸化配体的机制进行了探讨。

1 材料与方法

BRCT结构域的结构主要来源于 PDB数据库(表1)。ECT2 BRCT0-2和PTIP BRCT3-4的同源模建使用 Discovery Studio 2.5; ECT2 BRCT0-2和PTIP BRCT3-4同源模建的模板分别是 TopBP1 BRCT0-2和TopBP1 BRCT1-2(PDB ID: 2xnk)(Sheng et al, 2011)。ECT2 BRCT0-2和PTIP BRCT3-4与模板的序列比对使用“Align Multiple Sequences”模块;对于每个要模建的对象, 首先使用默认参数产生20个结构, 每个结构进行环区优化产生10个结构, 在产生的200个结构中选取总能量最低的作为模建结果。两个模建结构用Profile-3D进行结构兼容性评估。XRCC1 BRCT1、PTIP BRCT3-4、ECT2 BRCT0-2和TopBP1 BRCT0-2的同源序列来自NCBI nr数据库,序列搜索使用 Blastp, 采取默认参数(Altschul et al, 1997)。使用MAFFT方法, 采取genafpair策略(Katoh et al, 2002)分别对XRCC1 BRCT1、PTIP BRCT3-4、ECT2 BRCT0-2和 TopBP1 BRCT0-2的同源序列进行比对。将每个序列比对文件和对应的BRCT结构文件提交到ConSurf网站, 使用最大似然法依次计算 XRCC1 BRCT1、PTIP BRCT3-4、 ECT2 BRCT0-2和 TopBP1 BRCT0-2的结构保守性(Landau et al, 2005)。表面静电势计算使用PyMol中的 APBS模块(Schrodinger, 2010; Baker et al, 2001), 采取默认参数。

2 结 果

本研究主要分析了XRCC1 BRCT1(单体)、PTIP

BRCT3-4(II类二联体)、ECT2 BRCT0-2和 TopBP1 BRCT0-2(三联体)的结构保守性和表面静电势。PTIP BRCT3-4和ECT2 BRCT0-2的三维结构通过同源模建得到, 模建结构的 Profile-3D打分都位于最小期望值和最大期望值之间(PTIP BRCT3-4打分为62.36, 最小和最大期望值分别为37.94和84.31; ECT2 BRCT0-2打分为96.45, 最小和最大期望值为56.68和 125.96), 说明模建结构是合理的。结构保守性分析显示, XRCC1 BRCT1、PTIP BRCT4、ECT2 BRCT1、TopBP1 BRCT1和TopBP1 BRCT2中的磷酸结合口袋残基是保守的(残基ConSurf打分6～9,表1), 由于前四个BRCT有结合磷酸化配体的报道(Rappas et al, 2011; Masson et al, 1998; Munoz et al, 2007; Kim et al, 2005), 所以我们下一步的分析主要针对前4个BRCT。结果显示, XRCC1 BRCT1、PTIP BRCT4、ECT2 BRCT1和TopBP1 BRCT1的磷酸结合口袋周围还存在一些保守的区域(残基ConSurf打分5～9, 表1)。XRCC1 BRCT1的磷酸结合口袋周围有两个保守的区域：一个由 α1-和 β2-组成, 另一个由α1-和α3-组成(图1A)。PTIP BRCT4和TopBP1 BRCT1的表面保守区组成相似, 都是由 α1-延伸到β2-和β3-之间的环区(图1B, C)。ECT2 BRCT1的表面保守区由α1-至β2-区域延伸到BRCT0和BRCT1相互作用的区域(图1D)。这四个BRCT的保守区都在结构域表面形成以磷酸结合口袋为中心的沟槽。此外,这些BRCT表面不存在其它由三个或更多残基组成的保守区域。因此, 磷酸结合口袋及其周围的保守区形成的沟槽可能是这些BRCT重要的功能位点。

表1 本文使用的BRCT结构域的结构Tab. 1 Structures of BRCT domains

表面静电势分析显示, 这四个BRCT的磷酸结合口袋和保守区都带有较强的正电势(图 1E, H)。沟槽保守性和静电势的一致性提示我们, 这种沟槽可能是含有磷酸结合口袋的BRCT结构域的共同特征。为了验证这一假设, 我们还分析了其它含有磷酸结合口袋的 BRCT。结果显示, 结构较保守(ConSurf打分5～9的残基组成)的带正电势的沟槽也存在于一些蛋白如REV1(deoxycytidyl transferase)中的单体BRCT(表1), II类二联体的BRCTb如PTIP BRCT2和TopBP1 BRCT5(未给出具体数据)。I类二联体的特异性决定区也带有正电势并且周围是中性或带负电势区(图1I), RFC1结合DNA的位点也带有正电势(未给出具体数据)。此外, 在一些不含磷酸结合口袋的单体BRCT如XRCC1 BRCT2(图1J)、Pes1(pescadillo homolog 1) BRCT和TopBP1 BRCT6中, 磷酸结合口袋等同的位置不含或只有由结构上不保守(ConSurf打分 1～4)的少于五个残基组成的正电势区域。因此, 磷酸结合口袋周围带正电势的保守的沟槽很可能是BRCT与含有磷酸基团的配体相互作用的位点。

图1 BRCT结构域的结构保守性和表面静电势Fig. 1 The structural conservation and electrostatic surfaces of BRCT domains

我们对XRCC1 BRCT1、 PTIP BRCT4、 ECT2 BRCT1和 TopBP1 BRCT1进行比较后发现, 虽然这四个BRCT磷酸结合口袋周围的沟槽在形状上有所差异, 但都包含α1至β2区。四个BRCT的α1至β2区都含有保守的Arg, Lys或His, 但并没有发现在四个BRCT中均保守的残基(图2), 说明电荷在这些BRCT沟槽中的分布是不同的。PTIP BRCT4、ECT2 BRCT1和 TopBP1 BRCT1的沟槽都包含由α2和位于β2和β3之间的环区构成的表面区域, 但三个BRCT在该区域也没有共同保守的残基。这种沟槽区电荷分布和残基差异说明这些BRCT可能结合不同的配体。磷酸结合口袋位于沟槽的中心, 说明沟槽可能能够同时结合配体磷酸化氨基酸残基的两端序列。I类二联体的特异性决定区由BRCTa延伸至 BRCTb, 与此不同的是, XRCC1 BRCT1、PTIP BRCT4、ECT2 BRCT1和 TopBP1 BRCT1的沟槽主要分布于这四个BRCT内部, 说明识别特异性主要由单个BRCT决定。

图2 人 XRCC1 BRCT1, PTIP BRCT4, TopBP1 BRCT1和 ECT2 BRCT1的序列比对Fig. 2 Sequence alignment of human XRCC1 BRCT1, PTIP BRCT4, TopBP1 BRCT1, and ECT2 BRCT1

此外, 根据我们构建的四个 BRCT结构模型,我们还分析了沟槽氨基酸残基在其空间结构中的位置分布情况。结果显示, 沟槽两侧多为带正电荷和极性的氨基酸残基, 而底部多为疏水和极性氨基酸残基(图1K)。尽管I类二联体的特异性决定区也具有类似的残基分布(Williams et al, 2004), 但以上四个BRCT的沟槽含有三到四个带正电荷的氨基酸残基(α1至β2区), 而I类二联体如BRCA1和MDC1的特异性决定区只含有一到两个带正电荷残基 (人BRCA1：Arg1699和Arg1835)。因而, 沟槽区的更强的正电势使得这类BRCT结构域更倾向于结合带负电的配体。

3 讨 论

本研究发现XRCC1 BRCT1、PTIP BRCT4、ECT2 BRCT1和 TopBP1 BRCT1的磷酸结合口袋周围都有结构较保守的带正电势的沟槽, 类似的沟槽也存在于其它含有磷酸结合口袋的BRCT结构域中。而且RFC1中的沟槽是其结合DNA末端的区域, I类二联体中的沟槽是其结合磷酸化蛋白的特异性决定区(Glover et al, 2004; Kobayashi et al, 2010)。这些结果说明, 我们分析的这四个 BRCT的沟槽区可能具有容纳配体中磷酸基团附近区域的能力。

这四个BRCT可能采取与I类二联体相似的配体结合机制。在 I类二联体中, 磷酸结合口袋残基与配体磷酸丝氨酸中的磷酸基团形成氢键或盐键;特异性识别区两侧的正电残基与配体中的负电残水性氨基酸残基(Williams et al, 2004)。我们所研究的四个BRCT的沟槽区具有与I类二联体特异性识别区相似的残基空间排布, 说明这四个BRCT与配体的结合方式可能与I类二联体与配体的结合方式相似, 而且沟槽区的极性残基也可能与配体形成氢键。其中, 氢键和盐键等可能与配体结合亲和性有关, 疏水相互作用与配体结合的特异性有关, 但具体结合机制还有待进一步研究。I类二联体中磷酸结合口袋位于配体结合区的一端, 因而只能结合磷酸丝氨酸C端的序列, 但这四个BRCT的磷酸结合口袋位于沟槽的中部, 说明四个BRCT可能还会结合位于磷酸化残基N端的残基。

结合文献报道, 我们进一步推测了这些 BRCT可能结合的配体以及配体结合机制。XRCC1 BRCT1倾向于结合 PARP1(Poly(ADP-Ribose) Polymerase 1)中被寡聚的二磷酸腺苷-核糖基修饰的区域(Masson et al, 1998), 说明XRCC1 BRCT1可能结合二磷酸腺苷中的磷酸。TopBP1 BRCT1可以结合被CK2(caesin kinase2)磷酸化的RAD9 C端序列(SPVLAED[pS387]EGE)(Rappas et al, 2011)。从序列可以看出, 磷酸丝氨酸pS387两端都为带负电荷残基, 可能与TopBP1 BRCT1沟槽两侧的带正电荷残基相互作用。PTIP BRCT3-4 (II类二联体)和BRCT5-6(I类二联体)共同结合 53BP1 N端序列(DTPCLIIED [pS25]QPESQVLEDD), 而且BRCT3-4或 BRCT5-6都不能单独结合该序列(Munoz et al, 2007)。这两个二联体中只有 PTIP BRCT4和BRCT5有磷酸结合口袋, PTIP BRCT5-6倾向于结合磷酸丝氨酸 C-端第三位为疏水残基的肽段如pSQVF (Munoz et al, 2007), 但PTIP结合53BP1磷酸丝氨酸 pS25 C端的第三位为谷氨酸(Glu28), 因而可能不是 BRCT5-6结合磷酸丝氨酸pS25及其附近序列。另外, 53BP1 pS25两端三个残基的序列与TopBP1 BRCT1结合的RAD9的序列相同或相似, 而且PTIP BRCT4与TopBP1 BRCT1的沟槽区具有相似的电荷分布(图 2), 因此很可能是PTIP BRCT4结合 pS25及其附近的序列, 而BRCT5-6结合pS25 N-端或C端较远的序列。ECT2 BRCT0-2通过与ECT2 C-端的DH(Dbl homology)/ PH(pleckstrin homology)结构域区相互作用而抑制后者催化二磷酸腺苷转换三磷酸腺苷的功能(Kim et al, 2005), 这一功能可能受到磷酸化作用的调控,但具体的机制以及ECT2 BRCT1在其中的作用还不清楚。此外, 由于磷酸结合口袋附近的沟槽中存在一个较大的环区, 因此我们推测该区域所结合的配体残基可能会含有较小的侧链, 这一推测在 TopBP1 BRCT1配体上得到了证实, 其第389位为Gly残基。

综上所述, 本文探讨了BRCT结构域结合磷酸化配体的另一种可能的机制, 并为进一步研究BRCT结构域的功能机制奠定了基础。我们的结构模型对探讨不同BRCT结合磷酸化配体的特异性和亲和性分子机理有一定意义, 同时对 DNA损伤修复中的细胞周期调控机理研究有帮助作用。

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Functional site prediction of BRCT domain containing phosphate binding pocket

SHENG Zi-Zhang1,2, HUANG Jing-Fei1,3,*

(1.State Key Laboratory of Genetic Resources and Evolution,Kunming Institute of Zoology,the Chinese Academy of Sciences,Kunming650223China; 2.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences,Beijing100049China; 3.Kunming Institute of Zoology-Chinese University of Hong Kong Joint Research Center for Bio-resources and Human Disease Mechanisms,Kunming 650223,China)

The BRCT domain (after the C-terminal domain of a breast cancer susceptibility protein) is an important signaling and protein targeting motif in the DNA damage response system. To clarify possible interaction mechanisms between the BRCT domain, which contains phosphate binding pocket and its phosphorylated ligand, we analyzed the structural conservation and electrostatic surface potentials of XRCC1 BRCT1, PTIP BRCT4, ECT2 BRCT1 and TopBP1 BRCT1. The results showed common structurally conserved and positively charged grooves located around the phosphate binding pockets of these domains. These grooves possibly act as functional sites in the four BRCT domains due to the extensive existence of similar grooves in the BRCT domains containing phosphate binding pocket. The two sides of the groove were composed of positively charged and hydrophilic residues and the bottom was composed of hydrophobic and hydrophilic residues, suggesting that the groove binds to BRCT domain ligand mainly through electrostatic and hydrophobic interactions. The groove was mainly located in individual BRCT domains and differences in shape and charge distribution among the four BRCT domain grooves were observed, indicating that ligand binding specificity was predominantly determined by individual BRCT domains. The groove was centered by the phosphate binding pocket, implying that the groove interacted with residues located at both the N-terminal and C-terminal sides of the phosphorylated residue.

BRCT domain; Phosphate binding pocket; DNA damage repair; Electrostatic surface potential

Q5-3; Q811.4; TP399; R711.75

A

0254-5853-(2011)05-0509-06

10.3724/SP.J.1141.2011.05509

2011-04-11; 接受日期：2011-07-01

国家重点基础研究发展计划项目“973”(2009CB941302); 国家自然科学基金项目(30470939、30623007); 中国科学院基金项目(2007211311091)

∗通讯作者(Corresponding author), E-mail: huangjf@mail.kiz.ac.cn