龙须菜对3种赤潮微藻生长的影响

孙颖颖，张静，刘泓君，李灿，王长海

(1.淮海工学院 江苏省海洋生物技术重点建设实验室, 江苏 连云港 222005; 2.烟台大学 海洋学院，山东 烟台264005)

龙须菜对3种赤潮微藻生长的影响

孙颖颖1，张静1，刘泓君1，李灿1，王长海2

(1.淮海工学院 江苏省海洋生物技术重点建设实验室, 江苏 连云港 222005; 2.烟台大学 海洋学院，山东 烟台264005)

在共生条件下，研究了鲜龙须菜对前沟藻、米氏凯伦藻和塔玛亚历山大藻等3种赤潮微藻生长的影响。在此基础上，以龙须菜培养水过滤液和龙须菜水溶性抽提液为实验用液，分析它们对上述3种赤潮微藻的抑制作用。最后，采用甲醇浸泡龙须菜干粉末，研究了其甲醇提取物对3种赤潮微藻生长的影响。结果表明，当鲜龙须菜浓度≥ 32 g·L-1时，其能显著抑制3种赤潮微藻的生长，对它们的生长抑制率在42%以上。在龙须菜（浓度为32 g·L-1）培养水过滤液的实验中，发现无论一次性还是在半连续添加方式，培养水过滤液都对3种赤潮微藻表现出较为明显的抑制作用；同时发现，40～80℃下处理此培养水过滤液，其抑藻作用并未显著减弱，可见龙须菜抑藻物质有较高的热稳定性。当龙须菜水溶性抽提液浓度为16 g·L-1时，其显著了抑制3种赤潮微藻的生长。龙须菜干粉末的甲醇提取物同样能显著抑制3种赤潮微藻的生长，在甲醇提取物浓度为2.0 g·L-1时，对3种赤潮微藻的生长抑制率超过40%。上述结果表明，抑藻物质不仅存在于鲜龙须菜中，还存在于其干粉末中。

龙须菜；抑藻物质；赤潮微藻

研究表明，海藻不仅能够净化水质，还能与赤潮微藻进行营养竞争[1]，防止赤潮生物的爆发性繁殖与增长；同时，它们还能向环境中分泌抑藻物质，抑制赤潮微藻的生长[2-4]。目前，海藻抑制微藻的研究正在逐渐深入，已经发现某些海藻对微藻生长的抑制作用。例如，孔石莼（Ulva pertusa）抑制赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）和塔玛亚历山大藻（Alexandrum tamarense）[4]，龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）抑制锥状斯氏藻（Scrippsiella trochoidea）[5]、东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）和塔玛亚历山大藻[6]、鼠尾藻（Surgassum thunbergii）和小珊瑚藻（Corallina pilulifera）抑制赤潮异弯藻[7,8]。鉴于此，本文选定龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）为材料，采用共培养方法，研究了鲜龙须菜、龙须菜培养水过滤液和其水溶性抽提液对前沟藻（Amphidinium hoefleri）、米氏凯伦藻（Karenia mikimitoi）和塔玛亚历山大藻（Alexandrium tamarense）等3种赤潮微藻生长的影响。在此基础上，采用甲醇浸泡龙须菜干粉末，分析龙须菜甲醇提取物对上述3种微藻生长的抑制作用，以期为利用海藻防控赤潮提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

前沟藻、米氏凯伦藻和塔玛亚历山大藻无菌株由中国海洋大学提供。

龙须菜取自福建沿海，蒸馏水冲洗后，用混合抗生素对藻体作灭菌处理，再用灭菌海水漂洗3～4次，无菌培养于f /2培养液中，温度23±1℃，光强3 000 lx，光暗比16︰8。

天然海水经过脱脂棉和300目筛绢过滤，煮沸、冷却，pH 值和盐度分别调节至8.5和30备用（本文所用海水均做此处理）。

1.2 鲜龙须菜的抑藻实验

将指数生长期的微藻与鲜龙须菜同时接种于500 mL锥形瓶，内装200 mL f/2培养液。龙须菜浓度分别为0 g·L-1、4 g·L-1、8 g·L-1、16 g·L-1、32 g·L-1和64 g·L-1，前沟藻、米氏凯伦藻和塔玛亚历山大藻的接种密度依次为9×104mL-1、9×104mL-1和8 ×104mL-1，每个锥形瓶设3个重复。在光照培养箱内培养12 d，温度23±1℃，光强3 000 lx，光暗比16︰ 8（如未特别说明，后续实验培养条件相同）。每隔1日取样1 mL，用Lugol’s试剂固定后，测定藻细胞密度。同时，取样后向培养瓶中加入1 mL 200倍f/2培养液，以维持培养液体积恒定。

1.3 龙须菜培养水过滤液的抑藻实验

1.3.1 一次性培养 32 g·L-1鲜龙须菜培养在f/2培养液内，同时设定未培养龙须菜的空白锥形瓶（仅f/2培养液），每个锥形瓶设定3个重复。4d后移去龙须菜，培养液经高温灭菌的0.22 μm滤膜过滤。过滤液重新配制为f/2培养液，接种3种微藻。未培养龙须菜f/2培养液按照同样方法处理后，接种微藻，作为对照。

1.3.2 半连续培养 在数个培养缸内（内装f/2培养液）接种32 g·L-1鲜龙须菜，培养缸分为A和B 2组。4d后，移出A组培养缸内龙须菜，按照上述方法制备龙须菜培养水的过滤液，配制为f/2培养液后，用于3种微藻的培养。同时，将3种微藻分别接种于新鲜海水配制的f/2培养液中作为对照，每个锥形瓶内培养液总体积为200 mL。B组培养缸内的龙须菜继续培养，并为半连续培养供给龙须菜培养水过滤液。

每日从每个锥形瓶移取50 mL藻液，同时加入50 mL龙须菜培养水过滤液（来自于B组，并按照上述方法处理后，重新配制为f/2培养液）。对照组按照同样方法移取50 mL藻液，并加入50 mL新配制的f/2培养液。

1.3.3 温度对龙须菜培养水抑制作用的影响将数个装有100 mL龙须菜培养水的过滤液（按照上述实验方法制备）的锥形瓶分别置于40、60和80℃的水浴中加热，水浴时间60 min。待锥形瓶冷却至室温后，补充蒸馏水至100 mL，并将过滤液pH调为8.5，添加营养盐配制为f/2培养液，同时设定新鲜海水和龙须菜培养水过滤液配制的f/2培养液分别为对照1和对照2，接种3种微藻。

1.4 龙须菜水溶性抽提液的抑藻实验

48 g新鲜龙须菜研磨成浆后，加入灭菌海水，4 000g离心10 min，获得300 mL水溶性抽提液，并配制为f/2培养液。然后，用新鲜海水配制的f/2培养液将其依次稀释为2、4、8、16和32 g·L-1，用于前沟藻、米氏凯伦藻和塔玛亚历山大藻等3种微藻的培养。同时，将3种微藻接种于新鲜海水配制的f/2培养液中，作为对照。

在上述实验基础上，选定产生抑制作用浓度的水溶性抽提液。将此水溶性抽提液经高温121℃高温处理30 min。冷却后，按照f/2培养液添加营养盐后用于上述3种微藻的培养，同时以新鲜海水配制的f/2培养液培养微藻作为对照。

1.5 龙须菜甲醇萃取物的抑藻实验

新鲜龙须菜40℃干燥，研磨成粉末（粉碎至0.3 mm），甲醇浸泡4d，用滤纸过滤除去残渣。40℃减压蒸干，获得浸膏，称其质量后，用二甲基亚砜（DMSO）定容至10 mL。在无菌条件下，浓缩液通过0.22 μm无菌有机系滤膜过滤，于4℃冰箱备用。

通过前期预实验已发现DMSO投加比例＜ 1%对受试微藻的生长无影响，实验投加比例均控制在此范围内。移取一定体积此溶液添加到f/2培养液中，随后接种微藻。最终，甲醇萃取物浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 g·L-1，同时，添加相应体积的DMSO作为对照。

1.6 数据处理

数据采用SPSS11.5软件包进行独立样本检验统计分析，P＜ 0.05为显著性差异。

微藻的生长抑制率为：I =（ 1－N/N0）×100%，式中：N为处理组藻细胞数量（/×104mL-1）；N0为对照组藻细胞数量（/×104mL-1）。

2 结 果

2.1 共生条件下，鲜龙须菜对3种赤潮微藻生长的影响

图1表明，在共生条件下，鲜龙须菜对前沟藻、米氏凯伦藻和塔玛亚历山大藻的生长抑制显著（P＜0.05）并具有浓度效应。当鲜龙须菜浓度为16 g·L-1时，第12d其对前沟藻和米氏凯伦藻的生长抑制率在55%以上。对塔玛亚历山大藻而言，鲜龙须菜浓度 ≥ 32 g·L-1时，塔玛亚历山大藻生长被显著（P＜0.05）抑制，生长抑制率超过42%（第12 d）。在实验设定浓度范围内，未见鲜龙须菜对3种赤潮微藻的致死现象。

图 1 鲜龙须菜(■ 0, □ 4 g·L-1, ▲ 8 g·L-1, Δ 16 g·L-1, ● 32 g·L-1, ○ 64 g·L-1)对3种赤潮微藻生长的影响Fig.1 Effects of the fresh tissue (■ 0, □ 4 g·L-1, ▲ 8 g·L-1, Δ 16 g·L-1, ● 32 g·L-1, ○ 64 g·L-1) of G. lemaneiformis on the growth of three species of red tide microalgae

2.2 龙须菜培养水过滤液对3种赤潮微藻生长的影响

上述实验结果表明，32 g·L-1新鲜龙须菜能显著抑制3种赤潮微藻的生长。因此，在培养水过滤液实验中将龙须菜接种密度设定为32 g·L-1。从图2可以看出，无论在一次性还是在半连续添加方式下，龙须菜培养水过滤液对3种赤潮微藻的生长均有显著（P＜ 0.05）抑制作用，第12d龙须菜培养水过滤液对3种赤潮微藻的生长抑制率均超过41%。比较还发现，半连续添加方式下龙须菜培养水过滤液对3种赤潮微藻生长的抑制作用比一次性添加要更为强烈。

在40～80℃范围内处理龙须菜培养水过滤液，发现温度对龙须菜培养水过滤液作用于3种赤潮微藻的生长的抑制作用并无明显（P＞ 0.05）影响（图3）。

图 2 在一次性和半连续龙须菜培养水过滤液添加方式下3种赤潮微藻的生长曲线Fig.2 Growth curves of three species of red tide microagae under initial or semi-continuous culture medium filtrate addition of G. lemaneiformis

图 3 温度（■ 对照1，□ 对照2，▲ 40℃，Δ 60℃，● 80℃）对龙须菜培养水过滤作用于3种赤潮微藻生长的抑制作用的影响Fig.3 Effect of temperature (■ control 1，□ control 2，▲ 40℃，Δ 60℃，● 80℃) on the inhibitory activity of culture medium filtrate from G.lemaneiformis for the growth of three species of red tide microalgae

2.3 龙须菜水溶性抽提液对3种赤潮微藻生长的影响

较高浓度（16 g·L-1和32 g·L-1）的龙须菜水溶性抽提液能显著（P＜ 0.05）抑制3种赤潮微藻的生长（图4）。第12d，32 g·L-1龙须菜水溶性抽提液对3种的生长抑制率在62%以上。同时，当其浓度范围在2～8 g·L-1时，龙须菜水溶性抽提液对前沟藻、米氏凯伦藻和塔玛亚历山大藻的生长并没有明显（P＞ 0.05）的影响。

2.4 龙须菜甲醇提取物对3种赤潮微藻生长的影响

在图5中，当浓度超过1.0 g·L-1时，龙须菜甲醇提取物显著（P＜ 0.05）抑制了米氏凯伦藻的生长，第12d，甲醇提取物对米氏凯伦藻的生长抑制率在60%以上。对前沟藻和塔玛亚历山大藻而言，当龙须菜甲醇提取物浓度 ≥ 2.0 g·L-1时，同样显著（P＜0.05）抑制了此2种微藻的生长。

图 4 龙须菜水溶性抽提液(■ 0, □ 2 g·L-1, ▲ 4 g·L-1, Δ 8 g·L-1, ● 16 g·L-1, ○ 32 g·L-1)对3种赤潮微藻生长的影响Fig.4 Effects of aqueous extracts (■ 0, □ 2 g·L-1, ▲ 4 g·L-1, Δ 8 g·L-1, ● 16 g·L-1, ○ 32 g·L-1) of G.lemaneiformis on the growth of three species of red tide microalgae

图 5 龙须菜甲醇提取物(■ 0, □ 0.25 g·L-1, ▲ 0.5 g·L-1, Δ 1.0 g·L-1, ● 2.0 g·L-1, ○ 4.0 g·L-1)对3种赤潮微藻生长的影响Fig.5 Effects of methanol extracts (■ 0, □ 0.25 g·L-1, ▲ 0.5 g·L-1, Δ 1.0 g·L-1, ● 2.0 g·L-1, ○ 4.0 g·L-1) of G.lemaneiformis on the growth of three species of red tide microalgae

3 讨 论

本文选定我国沿海赤潮高发区常见赤潮微藻－前沟藻、米氏凯伦藻和塔玛亚历山大藻为实验对象，分析龙须菜对它们生长的影响。共生条件下，鲜龙须菜（浓度为32 g·L-1）显著抑制了前沟藻、米氏凯伦藻和塔玛亚历山大藻的生长（图1）。研究表明，种群间的相互作用和相互竞争一般通过2种途径进行：第一，细胞直接接触抑制；第二，分泌某些物质。Uchida等指出，圆磷异囊藻（Heterocapsa circularisquama）对米氏裸甲藻（Gymnodinium mikimotoi）的抑制作用主要是通过细胞直接接触[9]。颜天等认为，赤潮异弯藻对其它种群的抑制作用采取的是细胞直接接触抑制[10]。因此，为了确定共生条件下，鲜龙须菜对前沟藻、米氏凯伦藻和塔玛亚历山大藻的抑制作用途径，进行了龙须菜培养水过滤液的抑藻实验。

图2表明，龙须菜培养水过滤液一次性添加或半连续添加方式都对3种赤潮微藻的生长表现出一定的抑制作用，并且比较发现后者对3种赤潮微藻的抑制作用比前者更为强烈，这表明龙须菜释放到培养基中的抑藻物质的数量相对较多（足以产生抑制作用），释放方式是可连续性的，并且此抑藻物质可以在培养基中积累（应不属于快速降解物质）。Nakai等也发现穗状狐尾藻（Myriophyllum spicatum）通过连续分泌抑藻物质来抑制蓝藻生长[11,12]。在条浒苔（Enteromorpha clathrata）与三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）研究中，王兰刚等也认为鲜条浒苔持续向周围环境中分泌抑藻物质，当此物质累计到一定浓度时会对共培养的微藻产生强烈抑制作用[13]。随后，本文通过温度处理实验进一步证实，龙须菜释放的抑藻物质具有较高的热稳定性（图3），这为后续龙须菜抑藻物质的分离纯化工作提供了很好的实验基础。

从图4和图5可知，不仅鲜龙须菜中含有抑藻物质，在其干粉末中同样存在着抑藻物质。采用甲醇浸泡龙须菜干粉末后，其甲醇提取物（2.0 g·L-1）强烈地抑制了前沟藻、米氏凯伦藻和塔玛亚历山大藻等3种赤潮微藻的生长。这表明，后续工作中可利用甲醇进行龙须菜抑藻物质的初步分离。

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Effects of macroalgaGracilaria lemaneiformison the growth of three species of red tide microalgae under laboratory conditions

SUN Ying-ying1, ZHANG Jing1, LIU Hong-jun1, LI Can1, WANG Chang-hai2

(1.Jiangsu key laboratory of marine biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China; 2.School of Ocean, Yantai University, Yantai 264005, China)

To study the effects of freshGracilaria lemaneiformison the growth of the three species of red tide microalgae (Amphidinium hoefleri,Karenia mikimitoiandAlexandrium tamarense), those microalgae coexist with different initial inoculation concentrations of fresh tissue ofG.lemaneiformis, respectively.Furthermore, the inhibitory activities against three species of red tide microalgae of freshG.lemaneiformis’s culture filtrate and aqueous extracts ofG.lemaneiformiswere tested.The extracts were extracted from the dry powder ofG.lemaneiformiswith methanol, and to probe their inhibitory effects on the growth of those microalgae.The results showed that the fresh tissue ofG.lemaneiformishad strong growth inhibitory effect onA.hoefleri,K.mikimitoiandA.tamarenseat the concentration of 32 g·L-1and the growth inhibitory for three species of red tide microalgae was above 42%.The culture medium filtrate ofG.lemaneiformis(the concentration of 32 g·L-1) could significantly inhibit the growth of the three species of the red tide microalgae under initial or semi-continuous filtrate addition.The further investigation found that the culture medium filtrate ofG.lemaneiformisthat had gentle heat for 60 minutes under different lengths of temperature (40℃, 60℃ and 80℃) also had significant inhibitory effect on the growth of all test microalgae; this suggested that the inhibitory substances had higher thermal stability.The growth of all test microalgae was restrained by freshG.lemaneiformis’s aqueous extracts when concentration was 16 g·L-1.The methanol extracts ofG.lemaneiformisdry powder also inhibited significantly those three species of red tide microalgae at the concentration of 2.0 g·L-1, and the growth inhibitory for three species of red tide microalgae was above 40%.It indicated freshG.lemaneiformishad the inhibitory substances and inhibitory substances exited also inG.lemaneiformis’s dry powder.

Gracilaria lemaneiformis; inhibitory substances; red tide microalgae

Q949.2

A

1001-6932(2011)03-0328-06

2010-03-06 ；收修改稿日期：2010-10-07

江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放课题（2009HS09）。

孙颖颖（1978-），女，黑龙江桦南人，博士，讲师，主要从事海洋生化工程研究。电子邮箱：syy-999@163.com。