木蝴蝶提取物对大鼠实验性脉络膜新生血管的抑制作用

郑金华

(贵阳医学院 附属医院 眼科，贵州 贵阳 550004)

木蝴蝶提取物对大鼠实验性脉络膜新生血管的抑制作用

郑金华

(贵阳医学院 附属医院 眼科，贵州 贵阳 550004)

目的 探讨木蝴蝶提取物对实验性脉络膜新生血管的抑制作用，并分析其可能机制。方法 脉络膜新生血管模型大鼠90只随机分为激光光凝对照组(A组)、木蝴蝶提取物组(B组)和生理盐水组(C组)，A组不给药，B组给予木蝴蝶提取物100 mg/kg，C组给予生理盐水。分别在第1，7，21和28天观察新生血管发生率和血管内皮生长因子(VEGF)阳性表达情况。结果 脉络膜新生血管发生率都在第21天达高峰，B组与A、C两组比较有显著差异(P＜0．05)。从第7天开始，A、C两组光镜下均可见光凝斑部位机化增厚，Bruch膜破裂，B组在早期的炎症反应较轻。第3和7天，各组视网膜各层VEGF阳性表达无显著差异(P＞0．05)。第14和21天，A、C组VEGF阳性表达明显高于B组(P＜0．05或0．01)。结论 木蝴蝶提取物可以防治脉络膜新生血管的早期形成，VEGF在新生血管形成的早期起着关键性的作用。

木蝴蝶提取物;脉络膜新生血管;抑制作用;光凝

脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是多种病因引起的来源于脉络膜的新生血管形成，因其多发生于黄斑区，常引起患者中心视力下降，甚至导致失明［1-2］。在美国，超过65岁的人口中，将近20%患有老年性黄斑变性，而我国50岁以上的人口中患病率也在6% ～15%，其90%失明是由脉络膜新生血管引起的［3-4］。目前西医缺乏特异性好、疗效显著、不良反应少的脉络膜新生血管防治方法，积极利用中药提取物种类繁多、作用广泛的特点，开发中药防治脉络膜新生血管是一个方向。

木蝴蝶为紫葳科植物木蝴蝶的成熟种子，是一种常用中药。木蝴蝶化学成分以黄酮及其苷类为主，许多成分在黄芩中都已经发现过，可煎服、研末服用或外用敷贴。现代药理研究表明，木蝴蝶可以纠正模型大鼠晶状体的代谢紊乱，对大鼠半乳糖白内障有预防和治疗作用［5-6］。本文探讨了木蝴蝶提取物对实验性脉络膜新生血管的抑制作用，并探讨其可能作用机制，以期寻找一种新的药物治疗脉络膜新生血管的思路。

1 材料

木蝴蝶提取物(每1 g相当于生药10 g)，西安赛奥生物技术有限公司。碘化丙啶(PI)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、RPMI 1640培养基、小牛血清、EDTA Hanks液，上海生物工程有限公司;血管内皮生长因子(VEGF)原位杂交试剂盒，博士德试剂公司;SABC试剂盒、DAB显色试剂盒，广东中山试剂公司。

视网膜电图，美国Nicolet公司;半导体激光机，德国CanlzeiS公司。

Brown Norway(BN)大鼠，雌性，体重为200～300 g，购自北京动物实验中心，合格证号:SCXK(京)2007-0001。

2 方法

2．1 脉络膜新生血管模型的建立

BN雌性大鼠，经过裂隙灯显微镜检查及眼底检查，排除屈光介质和眼底异常大鼠。采用激光光凝诱导形成脉络膜新生血管。

大鼠腹腔注射氯胺酮(5 mg/kg)麻醉，双眼滴0．5%托吡卡胺溶液，将大鼠置于半导体激光机前，调整激光波长为810 nm，曝光时间0．1 s，光斑100 μm，通过裂隙灯眼底镜将瞄准光斑聚焦在视网膜上，然后进行光凝，每只眼光凝10次，光凝过程中适当调整激光功率(100～140 mW)，使激光光斑反应为Ⅲ级，以击穿Bruch膜。术后裂隙灯下检查双眼均未出现明显的眼底出血或玻璃体出血。

2．2 分组及给药

取模型大鼠90只，随机分为3组:激光光凝对照组(A组)、木蝴蝶提取物组(B组)、生理盐水组(C组)，每组30只。

A组大鼠不给药，B组大鼠灌胃给予木蝴蝶提取物100 mg/kg，C组大鼠灌胃给予等体积生理盐水，1 次/d。

2．3 观察指标

2．3．1 荧光素眼底血管(FFA)于激光光凝后第1，7，14，21和28天3组大鼠各取6只，用腹腔注射3%戊巴比妥钠(1 mg/kg)麻醉后，以10%荧光素钠(0．5 mg/kg)腹腔注射后立即开始摄影，观察脉络膜新生血管光斑数，计算脉络膜新生血管发生率。脉络膜新生血管发生率=(脉络膜新生血管光斑数/鼠眼总光斑数)×100%。

2．3．2 组织学检查 大鼠在相应时间点结束FFA检查后，用4%多聚甲醛全身灌流固定。随着每组各两只大鼠全身肌肉及尾部出现肌肉颤动为灌流成功，立即取出大鼠眼球。眼球置入4%甲醛固定液中室温过夜后，取视网膜，切成0．1 mm×0．5 mm×0．4 mm的组织块，磷酸缓冲液漂洗，锇酸固定，脱水包埋，切片，作HE染色及VEGF免疫组化染色。进行透射电镜观察。按试剂盒说明进行操作，用医学专业图像分析系统测定，计算VEGF的相对表达量。

3 结果

3．1 脉络膜新生血管的发生率

3组脉络膜新生血管发生率都在第21天达高峰，B组与A、C两组比较差异有统计学意义(P＜0．05)。A与 C组之间无统计学差异(P＞0．05)。见表1。

表1 3组不同时间点脉络膜新生血管的发生率比较

3．2 HE染色与电镜观察

从第7天开始，A组可见明显脉络膜新生血管形成，光凝斑部位机化增厚，Bruch膜破裂;B组未见视网膜结构的明显异常，光凝早期的炎症反应较轻;C组可见细胞移行，成纤堆细胞增生，光凝斑部位机化增厚，Bruch膜破裂。见图1。

3．3 VEGF免疫组化染色

第1和7天，各组视网膜VEGF阳性表达比较无统计学差异(P＞0．05)。第14天，A、C组VEGF阳性表达明显高于B组(P ＜0．05)。第21天，A、C组VEGF阳性表达进一步提高，明显高于B组(P＜0．01)。第28天，各组VEGF阳性表达均有所减弱。见表2。

图1 脉络膜新生血管形成观察结果(HE染色，200×)

表2 3组不同时间点VEGF在视网膜上表达比较(n=6，x±s)

4 讨论

木蝴蝶为紫葳科木蝴蝶属植物木蝴蝶的成熟种子，主要功效是清热利咽，舒肝和胃。有学者首先建立诱发糖性白内障模型，然后预防组在每日给予半乳糖的同时灌喂木蝴蝶水煎剂4 g/kg，结果半乳糖模型组第10天开始出现核混浊;而木蝴蝶组第20天才开始出现核混浊，保持大鼠透明晶状体的百分率明显高于半乳糖模型组，表明木蝴蝶可以纠正模型大鼠晶状体的代谢紊乱，对大鼠半乳糖白内障有预防和治疗作用［7］。

在实验性脉络膜新生血管中，目前多采用激光诱导的鼠的脉络膜新生血管动物模型，该模型已广泛用于新生血管抑制剂的筛选和相关脉络膜新生血管基因水平的研究［8］。本实验设计利用半导体激光光凝损伤脉络膜、Bruch膜产生一个炎症、新生血管和损伤修复的过程，而建立脉络膜新生血管动物模型。本文结果显示，木蝴蝶提取物可减少脉络膜新生血管的形成。

新生血管形成是许多血管生长因子介导的，如VEGF。VEGF一方面促进血管内皮细胞的分裂增生、迁徙、诱导血管腔的形成;一方面促进血管通透性增加，使血液中的纤维蛋白原等进入细胞外基质内形成纤维蛋白等，胞外纤维蛋白作为暂时性的基质允许新生血管和基质细胞的内向性生长，在某种程度上VEGF引起的血管通透性增加是被理解为血管形成的先决条件。本文结果显示，木蝴蝶提取物可减少视网膜VEGF的阳性表达。

在木蝴蝶的化学成分组成中，有黄芩苷元、黄芩苷、野黄芩素、黄芩苷元-6-葡萄糖醛酸、野黄芩苷等组分，而黄芩苷主要作用是抗氧化、清除自由基、抗炎、抗病，在眼科方面主要应用其抗病毒和调节免疫的功效，用来治疗病毒性角膜炎，我们认为发挥作用的可能是木蝴蝶提取物中的黄芩苷类化合物。

总之，木蝴蝶提取物可以防治脉络膜新生血管的早期形成，VEGF在新生血管形成的早期起着关键性的作用。

［1］ Jeffreyl，Edelman，Marisol R．Quantitative image analysis of laserinduced choroidal neovascularization in rat［J］．Exp Eye Res，2010，71(2):523-533．

［2］ Yasuo T，Toru Ka，Tsuyosbi K，et al．Suppression of laser induced choroidal neovascularization by oral tranilast in the rat［J］．Invest Ophthamol Vis Sci，2009，40(2):459-466．

［3］ 赵劲松，宋 跃．胚胎视网膜血管发生方式及其促进因子［J］．眼科研究，2010，18(1):89-91．

［4］ 秦力雄，余婉容，张文其，等．汉防甲素对体外培养的免结膜成纤维细胞抑制作用的实验研究［J］．眼科，2002，1l(1):37-40．

［5］ 高 于，吴鸣建，胡殿丽，等．木蝴蝶挥发油提取工艺优化及动力学模型研究［J］．应用化工，2008，37(1):11-13．

［6］ 苑立博，马 丽，卢 奎．微波辅助法提取桃仁油的工艺研究［J］．河南工业大学学报:自然版，2007，28(4):45-47．

［7］ 张 力，赵明威，黎晓新．影响光动力疗法治疗脉络膜新生血管视力预后的多因素分析［J］．中华眼底病杂志，2004，20(5):292-294．

［8］ 朱 洁，王雨生，惠延年．脉络膜新生血管的生成和抑制［J］．眼科新进展，2004，24(1):57-60．

The inhibition effects of Oroxylum indicum extract on the experimental choroidal neovascularization
ZHENG Jin-hua

(Ophthalmology Department，Hospital Affiliated to Guiyang Medical College，Guiyang 550004，China)

R285．5

A

1005-1678(2012)06-0843-03

2012-07-18

郑金华，女，硕士，主治医师，主要从事眼科角膜病方面的研究与治疗，E-mail:zhengjinhua_gy@163．com。