雄黄对大鼠脑组织中单胺类神经递质及其代谢产物的影响

霍韬光，林欣然，畅 蓓，李维凯，杨卉蕾，姜 泓＊

（1.中国医科大学 公共卫生学院，辽宁 沈阳110001； 2.中国医科大学 临床医药学院，辽宁 沈阳110001）

雄黄对大鼠脑组织中单胺类神经递质及其代谢产物的影响

霍韬光1，林欣然2，畅 蓓1，李维凯1，杨卉蕾1，姜 泓1＊

（1.中国医科大学 公共卫生学院，辽宁 沈阳110001； 2.中国医科大学 临床医药学院，辽宁 沈阳110001）

将32只 Wistar大鼠随机分为对照组（口服0.5% 羧甲基纤维素钠溶液）以及低剂量（0.3g/kg）、中剂量（0.9g/kg）和高剂量（2.7g/kg）雄黄混悬液处理组，通过4周连续灌胃给服雄黄混悬液；采用高效液相色谱－电化学法测定了大鼠脑组织中单胺类神经递质及其代谢产物的含量，研究了雄黄对大鼠脑组织单胺类神经递质及其代谢产物的影响.结果表明，与对照组比较，雄黄染毒组大鼠脑组织中NE、DOPAC和DA含量均呈增加趋势，而5－HIAA呈降低趋势.雄黄可对大鼠脑组织单胺类神经递质及其代谢产物产生影响，单胺类神经能系统可能是雄黄毒性作用的靶点之一.

雄黄；大鼠；脑组织；单胺类神经递质

雄黄为硫化物类矿物，主要成分为二硫化二砷（As2S2）[1]，另外还含有少量As2O3[As（Ⅲ）]和 As2O5[As（Ⅴ）]，为其主要的毒性成分.砷可引起认知障碍、智力低下等神经行为异常[2]，因此，雄黄及含雄黄中成药的中枢神经系统毒性已引起了人们的广泛关注.单胺类神经递质是中枢神经重要的信息传递物质，对注意力、记忆力和反应能力有重要的调节作用.检测单胺递质及其代谢产物，对研究这类递质的生理功能和与递质代谢功能异常有关的疾病的诊断具有重要意义[3－4].

目前，关于雄黄对大鼠脑组织中单胺类神经递质的影响还未见报道.作者采用高效液相色谱－电化学检测法测定雄黄染毒后大鼠脑组织中单胺类神经递质及其代谢产物含量的变化，为探讨雄黄对大脑中枢神经系统的毒性机制提供依据.

1 实验部分

1.1 药品与仪器

市售雄黄（成大方圆药店）；去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5－羟色胺（5－HT）、3，4－二羟基苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）、5－羟基吲哚乙酸（5－HIAA）对照品（Sigma公司）；实验试剂甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯.初断乳Wistar大鼠32只（中国医科大学实验动物部提供），体重50±10g，雌雄各半.

高效液相色谱仪（美国Waters公司），包括600E型输液泵，2465型电化学检测器，Empower 2色谱数据工作站.ER－182A全自动电子天平（十万分之一）（日本A＆D公司）；组织匀浆器（IKA广州仪科实验室技术有限公司）；3K－18超速冷冻离心机（Sigma公司）；pH－3C型酸度计（上海精密科学实业有限公司）；Easypure纯水系统（美国Barnstead公司）.

1.2 色谱条件

色谱柱为Thermo ODS column（250mm ×4.6mm i.d.，5μm）；流动相组成为缓冲液（30mmol/L柠檬酸三钠、0.3mmol/L庚烷磺酸钠，pH 5.0水溶液－甲醇混合液（95∶5，V/V）；柱温25 ℃；流速1.0 mL/min；进样量20μL.参比电极为Ag/AgCl电极，工作电极为玻碳电极，电极电势0.7V.

1.3 标准储备液的配制

精密称取NE、DA、5－HT、DOPAC、5－HIAA、HVA对照品各10mg，用0.1mol/L高氯酸溶解并定容至100mL容量瓶中，得浓度为100mg/L的储备液.

1.4 动物分组及给药

Wistar大鼠32只，按体重随机分成4组，每组8只.以0.5%CMC－Na水溶液为混悬介质，对照组（0.5%CMC）、实验用药组（0.3g/kg，0.9g/kg，2.7g/kg）灌胃给药，每日1次，连续给药4周.在动物灌胃期间每3天称重1次，调节灌胃剂量.所有动物均自由饮水和进食普通饲料.最后一次灌胃2h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，迅速开颅取大脑（冰浴下进行）.

1.5 样品处理方法

称取脑组织0.1g加入1mL 0.1mol/L高氯酸中匀浆2min，于4℃离心10min（13 000r·min－1），取上清液，过0.45μm滤膜后进样分析.

1.6 样品测定

在上述色谱条件下测定对照组及雄黄低、中、高剂量染毒组大鼠脑组织中单胺类神经递质及其代谢产物的含量.

1.7 统计分析

采用SPSS统计软件处理，数据用平均值 ±SD表示，用单因素方差分析（ANOVA）比较各染毒组与对照组大鼠脑组织单胺类神经递质及其代谢产物含量的统计学差异，以P＜0.05作为检验的显著性差异.

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

在实验色谱条件下进样分析，标准溶液和脑组织样品的色谱图见图1.由图1可知，6种单胺类物质在30min内实现了完全分离，脑组织中内源性物质不干扰测定.

2.2 标准曲线与精密度

精密量取储备液适量，用0.1mol/L高氯酸稀释，得标准系列溶液.NE、DA、DOPAC的标准系列溶液浓度为：10、20、50、100、200、500mg/L；5－HT、5－HIAA、HVA 的标准系列溶液浓度为：50、100、200、500、1 000、2 000mg/L.在实验色谱条件下，取6种单胺类物质标准溶液20μL进样分析.以各组分标准物质的峰面积为纵坐标（Y），以各组分的浓度为横坐标（X，mg/L）进行回归运算，得到线性回归方程（见表1）.在实验色谱条件下，连续6次测定浓度为200mg/L的标准溶液，计算6次测定所得峰面积的RSD值，结果RSD为0.83%～2.1%，表明仪器精密度良好.

图1 单胺类神经递质及其代谢产物的色谱图Fig.1 Chromatograms of monoamine neurotransmitters and their metabolites

表1 单胺类神经递质的标准曲线Table 1 Calibration curves of monoamine neurotransmitters

2.3 回收率

将浓度为100mg/L的6种单胺类物质标准溶液加入到脑组织匀浆液中，按“样品处理”项下操作，在实验色谱条件下分析，用线性回归方程计算浓度，用测得量（测定值与本底值之差）与加入量之比计算该方法的回收率，结果见表2.

表2 回收率测定结果Table 2 Result of sample recovery test （n ＝3）

2.4 雄黄染毒大鼠脑组织单胺类神经递质含量变化

对照组、雄黄染毒组大鼠脑组织中单胺类神经递质及代谢产物含量见图2.在大鼠脑组织中未检测到HVA，可能是由于脑组织中HVA含量较低，在本实验中未被检测到.经统计分析发现低剂量雄黄染毒组大鼠脑组织中NE与对照组比较无明显差异，中剂量和高剂量雄黄染毒组大鼠脑组织中NE含量显著高于对照组.低剂量和中剂量雄黄染毒组大鼠脑组织中DOPAC含量明显高于对照组，高剂量雄黄染毒组大鼠脑组织中DOPAC含量与对照组比较也有增加的趋势但不显著.雄黄染毒组大鼠脑组织中DA含量与对照组比较有增加的趋势但不显著；5－HIAA含量与对照组比较有降低的趋势也不显著.

3 结论

单胺类化合物是哺乳动物和人类中枢神经系统重要的神经递质及代谢产物，它们在脑中特定区域的浓度分布影响着垂体内分泌性能的协调并直接与神经活动相关.已有文献报道砷可引起脑组织中单胺类神经递质的变化[5－10].本实验发现大鼠给予雄黄染毒4周后，脑组织中单胺类神经递质含量发生了变化，NE、DOPAC、DA与对照组比较有增加的趋势，5－HIAA有降低的趋势，说明雄黄可对脑组织中单胺类神经递质产生影响，提示单胺类神经递质可能是雄黄神经毒性的靶点之一.

图2 脑组织中单胺类神经递质含量Fig.2 Contents of monoamine neurotransmitters in brain tissues

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Effect of realgar on monoamine neurotransmitters and their metabolites in brain tissues of rat

HUO Tao－guang1，LIN Xin－ran2，CHANG Bei1，LI Wei－kai1，YANG Hui－lei1，JIANG Hong1＊

（1.CollegeofPublicHealth，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，Liaoning，China；2.CollegeofClinicalMedicine，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，Liaoning，China）

32Wistar rats were categorized into control group and low dosage，moderate dosage，and high dosage realgar－treated groups.The control group was orally fed with the solution of 0.5%sodium carboxymethylcellulose for 4weeks，while the realgar－treated groups were treated with realgar suspension by gastric perfusion at a dosage of 0.3g/kg，0.9g/kg，and 2.7 g/kg，respectively，for the same duration.The content of monoamine neurotransmitters and their metabolites was determined by means of high performance liquid chromatography equipped with an electrochemical detector，and the effect of realgar on monoamine neurotransmitters and their metabolites in the brain tissues of the rats was investigated.Result shows that the contents of NE，DOPAC and DA in the brain tissues of realgar－treated groups tend to increase while the content of 5－HIAA tends to decrease as compared with the control group.In one word，realgar can affect monoamine neurotransmitters and their metabolites，and monoaminergic system may be one of the toxic targets of realgar.

realgar；rat；brain tissues；monoamine neurotransmitters

O 613.63

A

1008－1011（2012）01－0056－04

2011－07－10.

国家自然科学基金资助项目（81073144）；辽宁省自然科学基金资助项目（20092133）；辽宁省教育厅高等学校科研资助项目（L2010708）.

霍韬光（1983－），女，讲师，博士，从事含重金属矿物药毒作用机制研究.＊

，E－mail：jianghong＠mail.cmu.edu.cn.