离子色谱法同时测定胞外培养液中的有机酸与核苷酸

法芸 杨海燕 朱新术

（中国科学院青岛生物能源与过程研究所公共实验室，山东青岛 266101）

离子色谱法同时测定胞外培养液中的有机酸与核苷酸

法芸 杨海燕 朱新术

（中国科学院青岛生物能源与过程研究所公共实验室，山东青岛 266101）

建立了一种利用阴离子交换色谱柱分离，抑制型电导检测器同时测定乳酸、丙酸、丙酮酸、苹果酸、磷酸二羟丙酮、柠檬酸、异柠檬酸7种有机酸和单磷酸核苷酸（AMP）、双磷酸核苷酸（ADP）、三磷酸核苷酸（ATP）3种核苷酸的方法。采用IonPac AS11－HC阴离子交换柱，KOH梯度洗脱，流速1.00mL／min，柱温30℃，进样体积25μL。方法的相对标准偏差为0.39%～4.69%，线性相关系数为0.9906～0.9996，加标回收率为80.71%～94.02%，方法可用于嗜热厌氧菌胞外培养液中有机酸和核苷酸的同时测定。

离子色谱；电导检测器；梯度洗脱；有机酸；核苷酸

1 前言

有机酸和核苷酸是一类在细胞代谢上极为重要的物质，它们几乎参与细胞的所有生化过程。近年来细胞的新陈代谢和通量研究已被广泛关注，通过分析细胞代谢物的某些成分，特别是重要代谢物成分的检测，对准确的阐明新陈代谢的途径有着非常重要的意义［1］。

比色法、分光法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法等都可用于有机酸的测定，但这些方法一般需要对样品进行复杂的预分离或衍生化，且同时分离检测的有机酸种类较少。离子色谱法因其分析速度快、灵敏度高、能实现多组分同时分离定量等优点，已经成为分析有机酸的有效方法［2］。目前国内外测定核苷酸的方法，主要有离子交换液相色谱法和反相液相色谱法，多数利用紫外检测器进行测定［3］。利用离子色谱法，电导检测器同时测定有机酸和核苷酸的报道很少。采用阴离子交换色谱和电导检测法，建立了优化的梯度洗脱程序，实现7种有机酸和3种核苷酸的同时检测。

2 实验部分

2.1 仪器与材料

ICS 5000多功能色谱装置（美国ThermoFisher公司），包括双泵（DP）模块、抑制电导检测器／（DC）模块、淋洗液自动发生模块（EG）、自动进样器（AS）模块；Milli－Q Advantage A10超纯水制备仪。

有机酸标准品：乳酸、丙酸、丙酮酸、苹果酸、磷酸二羟丙酮、柠檬酸、异柠檬酸7种有机酸及单磷酸核苷酸（AMP）、双磷酸核苷酸（ADP）、三磷酸核苷酸（ATP）均为色谱纯（购于美国Sigma公司）；

2.2 样品制备

取1mL发酵液置于2mL塑料离心管中，以6 000r／min速度离心5min，固体沉淀于离心管底。取适量上清液，用水稀释100倍，稀释液过IC－RP柱除去蛋白、色素等有机杂质。经0.23μm滤膜过滤除去微米级悬浮物。

IC－RP柱（1.0mL，Agela Technologies）使用前须先经5mL甲醇、10mL水活化，放置20min后使用。当样品溶液通过该柱时，前面3mL弃去，后面溶液待检测。

2.3 标准曲线的绘制

分别配制乳酸、丙酸、丙酮酸、苹果酸、磷酸二羟丙酮、柠檬酸、异柠檬酸、AMP、ADP、ATP质量浓度均为1g／L的储备液，然后用其配制成质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、3.0、6.0、12.0、25.0、50.0mg／L的系列混合标准溶液。按不同浓度分别进样，以峰面积－浓度绘制各组分的标准曲线。

2.4 色谱条件

IonPac AS11－HC阴离子交换柱，包括分析柱（250mm×4mm）和保护柱（50mm×4mm）。采用KOH梯度淋洗，流速1.00mL／min，柱温30℃，进样体积25μL。梯度淋洗程序如表1所示。

表1 梯度淋洗程序Table 1 Gradient elution program

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的选择

选用亲水性较强、IonPac AS11－HC阴离子交换柱，可以减少疏水性离子在树脂上的吸附，缩短这些组分的保留时间并改善峰形。高的柱容量有利于复杂样品中浓度差别较大组分的分析。以KOH为淋洗液，能同时分离与树脂结合力不同的阴离子，并且抑制产物是水，本底电导比较低。由于ADP特殊的分子结构，它的两个磷酸基团都可以和树脂发生作用，与树脂的结合力最强，核苷酸ADP与固定相的亲和力远远大于小分子有机酸根离子和其他核苷酸，最不易洗脱。为使10种组分在一定的时间内完全洗脱，故采用梯度淋洗方法。以2.4节所述的梯度淋洗程序进行洗脱，10种待测组分一次进样可以得到很好的分离并保证峰形和分辨率，各种组分的出峰时间小于35min。图1为混合标准溶液的色谱图。

3.2 干扰试验

细胞培养液的成分复杂，为验证在选择的色谱条件下是否能很好地将目标离子与其他离子分离，配制含有氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子的混合标准溶液，在2.4节条件下直接进样测定。实验结果表明，上述常见阴离子对待测组分的出峰无干扰。

图1 混合标准溶液的色谱图Figure 1.A chromatogram of the mixed standard solution.

3.3 重复性、标准曲线和加标回收率

用标准储备液配制成质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、3.0、6.0、12.0、25.0、50.0mg／L的系列混合标准溶液。依次进样，以峰面积Y为纵坐标、标准溶液的质量浓度X（mg／L）为横坐标进行线性回归。选择浓度分别为6.0mg／L混合标准溶液连续进样8次，测得相对标准偏差为0.39%～4.69%。选择一个热纤梭菌胞外培养液进行加标水平的回收率测定。上述实验所得线性回归方程、相关系数、相对标准偏差、回收率如表2所示。实验测得的线性相关系数均大于0.99，表明7种有机酸和3种核苷酸都具有良好的线性关系。

表2 线性方程、线性相关系数、相对标准偏差Table 2 Regression equations，correlation coefficients（r），and relative standard deviations

3.4 样品分析

将热纤梭菌胞外培养液样品按照2.2所述方法进行前处理，在KOH梯度洗脱程序下，样品中有机酸和核苷酸得到了较好分离，峰形尖锐。得到的组分浓度分别为乳酸234.14mg／L、丙酸58.98mg／L、丙酮酸87.24mg／L、柠檬酸2 500.68mg／L、AMP 318.00mg／L、ADP 757.80mg／L、ATP 920.14mg／L。图2为测定热纤梭菌胞外培养液中有机酸和核苷酸的色谱图。

图2 热纤梭菌胞内提取物样品的色谱图Figure 2.A chromatogram of the clostridium thermocellum cell extract.

4 结语

阴离子交换色谱，电导检测器可用于同时测定热纤梭菌胞外培养液中的有机酸和核苷酸，方法简单易行，灵敏度、重现性和相关性好，为发酵工艺过程中技术监控和质量控制提供了有效的分析方法。

［1］Loret MO，Pedersen L，Francois J.Revised procedures for yeast metabolites extraction：application to a glucose pulse to carbon－limited yeast cultures，which reveals a transient activation of the purine salvage pathway［J］.Yeast，2007，24（1）：47－60.

［2］钱兵，章燕，李莎，等.反相高效液相色谱法测定丙酸发酵液中的有机酸［J］.分析化学研究简报，2007，35（11）：1651－1653.

［3］李意.离子交换色谱法测定小球藻提取物中的核苷酸［J］.分析化学研究简报，2004，32（8）：1077－1079.

Simultaneous Determination of Organic Acids and Nucleotides in Extracellular Media by Ion Chromatography

FA Yun，YANG Haiyan，ZHU Xinshu

（PublicLaboratory，QingdaoInstituteofBiomassEnergyandBioprocessTechnology，ChineseAcademyofScience，Qingdao，Shandong266101，China）

A new method using ion－chromatography with anion exchange column and suppressed conductivity detection was established to simultaneously determining seven organic acids including lactic acid，propionic acid，pyruvic acid，malic acid，dihydroxyacetone phosphate，citric acid，isocitric acid，and three kinds of nucleotides including AMP，ADP，and ATP.The separation was performed on an IonPac AS11－HC column with KOH solution as the mobile phase at a flow rate of 1.00mL／min and at 30℃of column temperature and with the injection volume of 25μL.The relative standard derivation and the correlation coefficient was 0.39%～4.69%and 0.9906～0.9996，respectively.The recovery ranged from 80.71%to 94.02%.The method has been applied to simultaneously determine organic acids and nucleotides in thermoanaerobacter extracellular media with satisfactory results.

ion－chromatography；the suppressed conductivity detector；gradient elution；organic acid；nucleotides

法芸，女，高级工程师，主要从事色谱分析。E－mail：fayun＠qibebt.ac.cn

O657.7＋5；TH833

A

2095－1035（2012）03－0066－03

10.3969／j.issn.2095－1035.2012.03.021

2012－07－03

2012－08－06

中科院仪器设备升级改造项目（yg2010072）；山东省科技发展计划项目资助（2011SJGZ06）。