香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414对小鼠肝癌细胞Hca生物学功能的影响

刘 奔，钟民涛，王晓丽，孙文长，宁安红，李星云，刘 磊，黄 敏

(大连医科大学 微生物学教研室，辽宁 大连 116044)

香菇菌C91-3具有气味甘平、无毒、健脾益气、扶正祛邪,调和阴阳的药食兼用特点[1]。以往的研究表明其发酵液具有良好的抗肿瘤、抗细菌作用。其发酵液中除含有大量多糖和氨基酸成分外,还含有多种蛋白成分。经体内及体外实验证实，其中的一些蛋白组分具有很高的诱导细胞凋亡的能力[2-3]。为明确香菇菌中蛋白的抗肿瘤作用，本课题组对其转录组进行了高通量测序，获得了香菇菌C91-3的转录组序列。通过GenBANK、SWISS-MODEL等数据库比对分析，初步筛选确定了其凋亡相关的转录组序列，并根据此转录组序列设计引物，用3′-Full RACE、5′-Full RACE(Rapid Amplificatioon of cDNA Ends)方法获得了基因全长。通过毕赤酵母表达体系诱导表达出此目的蛋白，并将鉴定后的蛋白作用于小鼠肝癌细胞Hca，经流式细胞术等方法检测其对肿瘤细胞Hca生物学功能的影响，进而分析其是否具有诱导肿瘤细胞凋亡的功能，为进一步深入研究香菇菌C91-3的抗肿瘤机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 实验仪器：低温离心机：Eppendorf ，德国。 PCR扩增仪：Takara Thermal Cycler TP600，Takara BIO INC。超净工作台：SW-CJ-1FD型，蚌埠净化设备厂。核酸电泳仪：Mupid，ADVANCE-BIO Co.,Ltd。蛋白电泳仪：EPS300，上海天能。凝胶成像分析系统：北京六一实验仪器厂。基因测序仪：ABI PRISMTM3730XL DNA Sequencer，Applied Biosystem。

1.1.2 实验试剂：总RNA提取Trizol试剂盒、Penta.His Antibody、HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)购自invitrogen公司，3′-Full RACE Core Set Ver 2.0 、5′-Full RACE Kit、BigDye Terminater V3.1 Cycle Sequencing Kit、Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒及实验所需各种引物、酶类均购自宝生物工程(大连)有限公司，各种培养基为本实验室配置。

1.1.3 质粒、菌株与细胞株：质粒pPIC9K、菌株DH5α、毕赤酵母GS115购自invitrogen公司(中国)；小鼠肝癌细胞Hca购自中科院上海生化与细胞所；鸡胚成纤维细胞，本实验室制备。

1.2 实验方法

1.2.1 香菇菌C91-3总RNA提取与24414基因CDS区序列的获得：取综合马铃薯培养基培养18 d的香菇菌C91-3的菌丝体，于研钵中加入液氮充分研磨，用Trizol试剂盒按说明一步法提取总RNA，将所得总RNA溶于50 μL DEPC水中。引物设计采用oligo 6.0设计软件，根据转录组测序结果，设计合成3′-RACE、5′-RACE实验所需特异性引物，通过3′-Full RACE、5′-Full RACE反应得到香菇菌C91-3 24414基因CDS区序列。实验所需引物序列如下：

(5′→ 3′)：3′RACE Outer Primer 1：GAAATGGTCCTAGTTCCCGTG； 3′RACE Outer Primer 2：TA-GATGCCAGGGACCGCTTCT； 3′RACE Inner Primer 1：CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG； 3′RACE Inner Primer 2： AGTAGGGCTTCATGTGCTT； 5′RACE Outer Primer 1：CCGGGAATGTGTCTGTTGTTA； 5′RACE Outer Primer 2：CCGTTTTACAAGTTT-TTCGTT； 5′RACE Inner Primer 1：CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG； 5′RACE Inner Primer 2：ATGCGCGTAGGTAGACTTTGA； F Primer：ACTGGCGCGTGAGCCACTCG； R Primer：GCCCTG-AGGTCCAAACATTG； R1seq primer：ACCTCGGCAACAAACCCCAA； 5′AOX I primer：GACTGGTTCCAATTGACAAGC； 3′AOX I primer：GGCAAATGGCATTCTGACAT。

1.2.2 酵母真核表达载体构建、阳性转化子培养及诱导表达：构建真核重组表达质粒pPIC9K-24414，采用毕赤酵母GS115体系进行诱导表达，其目的蛋白末端加入6×His鉴定、纯化标签，得到鉴定的香菇菌C91-3凋亡相关目的蛋白24414[4]。

1.2.3 MTT法测定目的蛋白的抑瘤率：选取对数生长期的Hca小鼠肝癌细胞，调整细胞数为1×105个/mL，加于96孔培养板，每组设3个复孔，终体积200 μL。实验分为5组：不同浓度目的蛋白3组，化疗药物顺铂(DDP)组与培养基空白对照组。所有成分用RPMI-1640配制，目的蛋白为鉴定后的诱导表达72 h的产物，分别稀释至终浓度7.5 μg/mL、15 μg/mL、30 μg/mL，化疗药物DDP终浓度为5.0 μg/mL，于37 ℃作用于对数生长期的Hca细胞24 h、48 h、72 h后，用 MTT法进行检测，测定波长595 nm，参考波长655 nm，按照下面公式计算抑瘤率(细胞生长抑制率)：IR(inhibited rate)=(对照组平均A值-实验组平均A值)/对照组平均A值×100%。

1.2.4 目的蛋白对肿瘤细胞Hca凋亡作用检测：细胞分组同上，选取对数生长期的小鼠肝癌Hca细胞，调整细胞数为1×105个/mL，加入25 mL培养瓶，每瓶3 mL。用药及药物作用浓度同上，混匀后，37 ℃，5%CO2孵育24 h，细胞悬液800 r/min，离心3 min，再以PBS洗涤1次，800 r/min离心3 min；按试剂盒说明加入Annexin/PI染液，避光孵育15 min后以流式细胞仪检测，使用Cell Quest软件进行分析。

1.2.5 目的蛋白对正常鸡胚成纤维细胞毒性检测：制备鸡胚成纤维细胞悬液[5]，分组同上，调整细胞浓度至1×105个/mL，分装于96孔板，二氧化碳培养箱中37℃培养24 h，观察鸡胚成纤维细胞贴壁良好时用药同上，每组设3个复孔，37 ℃继续培养，于24 h、48 h、72 h采用 MTT法进行检测，测定波长595 nm，参考波长655 nm。

1.3 统计学方法

使用SPSS11.0统计软件进行实验数据分析，采用组间t检验，P<0.05为差异有显著性意义。

2 结 果

2.1 香菇菌C91-3总RNA提取

取5 μL总RNA进行2%琼脂糖凝胶电泳，marker上样量为5 μL，结果见图1，示RNA完整无降解。

2.2 香菇菌C91-3 24414基因CDS区获得

RT-PCR反应结束后，取5 μL的RT-PCR反应液进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，marker上样量为5 μL，确认PCR扩增产物，见图2。在大约3000 bp处可见清晰条带，条带大小与拼接结果吻合，同时M-MLV逆转录酶阴性对照[M-MLV(-)]无条带出现，示无假阳性结果。

图1 香菇菌C91-3总RNAFig 1 Total RNA of Lentinus edodes C91-31：香菇菌C91-3总RNA； M：DNA Marker DL2000

图2 香菇菌C91-324414基因CDS序列全长Fig 2 Full CDS sequence of Lentinus edodes C91-3 24414 gene

M：DNA Markerλ-Hind Ⅲ digest ；1：M-MLV(-)PCR 产物；2：PCR 产物

2.3 诱导表达目的蛋白的鉴定

通过Western-blot方法确认目的蛋白的表达情况，一抗稀释倍数为1∶1000，二抗稀释倍数为1∶1000，显色底物为True Blue Peroxidase Substrate，反应条件均为室温1 h,结果见图3。在蛋白电泳大于110 kD位置处有抗His-Tag 阳性的蛋白条带，空载体对照组无条带。

图3 诱导表达不同时间目的蛋白的鉴定

Fig 3 Characterization of target protein on different time span of induction

M：Precision Plus Protein Standards Dual color ； 1：24414-1胞外 (72 h)；2：24414-1胞外 (48 h)； 3：24414-1胞外 (24 h)；4：空载体pPIC9K 胞外 (48 h)

2.4 MTT法测定目的蛋白的抑瘤率

不同作用时间、不同浓度的目的蛋白对Hca细胞的MTT检测结果，见表1，抑瘤率见表2。24 h后，蛋白作用组与DDP作用组的A值与对照组比较差异即有显著性意义(P<0.05)，且蛋白作用组的A值与DDP作用组比较差异也有显著性意义(P<0.05)。表2所示，Hca细胞在各浓度目的蛋白作用下，生长明显受到抑制，其抑制水平超过5 μg /mL DDP的作用。

表1 不同时间、不同浓度的目的蛋白对Hca细胞的MTT检测结果Tab 1 The MTT result of the expressed protein to Hca cell on different time span (±s)

1) 与对照组比较，P<0.05；2) 与5 μg/mL DDP组比较，P<0.05

表2不同时间、不同浓度目的蛋白对Hca细胞的抑瘤率

Tab 1 Cell inhibited rate of the expressed protein to Hca cell on different time span(%)

2.5 目的蛋白对肿瘤细胞Hca凋亡作用检测

目的蛋白作用于Hca细胞24 h后，经Annexin/PI双染色法染色，以流式细胞仪检测细胞凋亡率，测量3次，以Cell Quest软件分析检测肿瘤细胞凋亡结果，见表3和图4。图4中，右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞，左上象限为死亡细胞，左下象限为正常状态细胞。结果表明，目的蛋白作用浓度为7.5 μg/mL时，其晚期凋亡率已高于对照组细胞，即对Hca细胞已具有诱导凋亡的作用，浓度为30 μg/mL时诱导凋亡的作用最强，早晚两期凋亡率最高。肿瘤细胞在蛋白的作用下对理化作用的耐受性降低，细胞碎片增多，死亡细胞数目亦明显增多。

表3 不同浓度的目的蛋白对Hca细胞的凋亡率Tab 2 The apoptosis rate of the expressed protein on Hca cell (%)

1) 与对照组比较，P<0.05

2.6 目的蛋白对正常鸡胚成纤维细胞的毒性检测

不同浓度目的蛋白对正常鸡胚成纤维细胞的毒性检测见表4。鸡胚成纤维细胞在不同浓度的目的蛋白作用下生长没有受到抑制，与对照组比较差异没有显著性意义。而在5 μg /mL 的DDP作用下，细胞生长在24 h即出现抑制，与对照组、各蛋白作用组比较差异有显著性意义(P<0.05)。

对照组目的蛋白组7.5μg/mL15μg/mL3μg/mL5μg/mLDDP24h1.817±0.0641.657±0.0891.789±0.1491.581±0.1400.773±0.4121)48h1.059±0.1000.990±0.0791.070±0.1541.118±0.1220.693±0.0901)72h0.939±0.0770.903±0.0810.931±0.1730.827±0.1090.522±0.0631)

1) 与其余4组比较，P<0.05

3 讨 论

细胞凋亡是一个主动的、信号依赖的过程，它可以由许多因素所诱导，如放射线照射、毒素、药物、缺血缺氧、病毒感染等。和细胞增殖一样，细胞凋亡也是受基因调控的精确过程[6]。目前，已经证实的凋亡相关蛋白在肿瘤细胞的增殖及凋亡过程中均起到关键作用[7]。研究表明，香菇菌提取物除具有抗病毒、抗细菌及免疫调节等生物功能外还具有抑制肿瘤增殖的功能[8]。Liao CH等[9]从松衫灵芝中提取的真菌免疫调节蛋白能诱导体外培养的肺癌A549肿瘤细胞过早地凋亡和过早地衰老，证明了具有体外直接杀伤肿瘤作用的蛋白成分在药用真菌中真实存在。Hsu HC等[10]从草菇中分离的真菌免疫调节蛋白在体外对肿瘤细胞具有直接抑制作用，进一步证明从真菌中可以分离得到具有直接抗肿瘤作用的蛋白。本课题组从香菇菌C91-3菌丝体发酵液中提取的蛋白LFP91-3就已在抗多种肿瘤细胞的实验中取得了良好的结果[2-3]， 并已证实该发酵液蛋白具有体外抗肿瘤和体内直接杀伤肿瘤细胞的作用[2,11]。

本课题组通过转录组测序、凋亡相关蛋白序列比对、真核表达载体构建、酵母系统表达等手段得到了香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414，目的蛋白在1%甲醇诱导后24 h即有表达，表达量较恒定，经检测在72 h达到峰值0.3 mg/mL[4]。MTT法进行体外抗肿瘤活性的测定，发现该蛋白对肿瘤细胞Hca具有明显的抑制作用，7.5 μg /mL、15 μg /mL、30 μg /mL目的蛋白的抑制率在24 h分别为50.49%、72.84%和72.96%。作用48 h后，15 μg /mL、30 μg /mL目的蛋白组出现组内最大抑制率，分别为82.02%和74.66%，可以看出此蛋白对Hca细胞的抑制率不完全是时间、浓度依赖性的。作者分析这与生长抑制作用通路中的某些因素有关，其具体机制需要深入研究。作用24 h后，通过流式细胞仪检测，目的蛋白作用浓度为7.5 μg/mL时，早期凋亡率和晚期凋亡率分别为0.47%和4.26%；目的蛋白作用浓度为30 μg /mL时，早期凋亡率和晚期凋亡率分别达到9.28%和9.37%，两期凋亡率均随蛋白作用浓度增加而增加，晚期凋亡略占优势。此结果证实，该蛋白具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，在作用24 h时肿瘤细胞出现的早期凋亡率和晚期凋亡率随着单一蛋白作用浓度的增加而增加，表现出剂量-效应关系。同时，从毒性检测的结果中可以看出此蛋白对正常鸡胚成纤维细胞无毒性作用，鸡胚成纤维细胞在不同浓度的目的蛋白作用下生长没有受到抑制，与对照组比较差异没有显著性意义。这一结果表明该蛋白诱导细胞凋亡具有肿瘤细胞选择性，其具体的诱导肿瘤细胞凋亡的机制、途径有待研究。

目前的抗癌药物多是通过诱导细胞凋亡发挥其细胞毒副作用。但几乎所有的抗癌药物都存在不同程度的毒副作用。抗癌药物的抑瘤效果和毒副作用对其剂量存在的依赖性,产生了治疗与毒副作用的矛盾[12]。因此,筛选低毒或无毒副作用且抑癌效率高的抗癌药物具有很高的临床价值。本课题组将继续对此蛋白的分子结构、理化性质、生物学功能进行深入研究。

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