MODS技术的研究和应用进展

黄自坤，李俊明

（南昌大学第一附属医院 检验科，江西 南昌330006）

早期发现和诊断结核病（Tuberculosis，TB）病人、及时选用敏感药物给予有效治疗，是减少TB传播机会、控制TB疫情的关键环节。目前，病原学诊断仍是TB诊断的金标准，也是判断疾病活动性、传染性和疗效考核的主要指标。传统的TB病原学检查主要是涂片抗酸染色检查和罗氏培养基培养法（L－J法）。抗酸染色的优点是操作简单，快速，但敏感性差，阳性率仅为30－40%。L－J法敏感性较好，但由于结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）生长缓慢，检测时间要求很长（一般为4周），加上药敏分析的时间，报告周期一般需要2个月左右，很难满足临床需要［1］。

MTB全自动培养系统的出现是TB诊断的一个巨大进步，不仅使得MTB培养的敏感性获得了很大的提高，培养的时间也明显缩短［2］。但该方法只在一些发达国家得到了一定的应用，而全球TB患者绝大部分分布在经济相对落后的发展中国家。因此，研发快速、可靠、适于在发展中国家推广的TB诊断和药敏检测技术仍是包括我国在内的广大发展中国家急待解决的主要问题之一。

显微镜观察药敏检测技术（microscopic observation drug－susceptibility assay，MODS）是近年来建立的一种结核病病原学检测新技术，与传统病原学检测方法相比，具有敏感性好、检出时间短、可同时进行药敏分析、无需昂贵的特殊设备和检测成本低等优点，被认为是一种适于在发展中国家推广使用的TB诊断和药物敏感性检测方法，受到越来越多的关注。近年，MODS技术的研究和应用取得了很大的进展，本文就MODS技术的研究和应用进展，以及目前面临的挑战作一综述。

1 MODS技术的原理及主要特点

MODS技术的主要原理是利用MTB在适宜的液体培养基中的生长速度较在固体培养基上快，且会形成特征性的索状结构的特性，利用液体培养基对痰、胸水或脑脊液等标本进行直接培养，并在一定时间内在显微镜下观察是否形成特征性索状结构，以判断标本中是否存在MTB的方法。MODS技术一般采用24孔细胞培养板进行MTB的培养，培养至一定时间后定期在倒置显微镜下观察MTB生长形成的特征性索状结构。若在培养时设置加有一定浓度抗结核药物的培养孔，对比含和不含药物的培养孔内MTB的生长情况，即可对待检MTB的药物敏感性进行评价［3］。

目前，MODS技术一般采用含10%OADC添加剂的M7H9液体培养基进行MTB培养，阳性标本一般可在7天左右观察到特征性的索状结构。同时，由于MODS技术可直接对临床标本进行培养以获得其中MTB的药物敏感性信息，而不像传统的药敏检测方法那样需要利用MTB纯培养物进行分析，因此与传统病原学诊断方法相比，其检测时间大大缩短。此外，MODS技术还具有远高于传统病原学诊断方法的敏感性，以及远低于MTB全自动培养方法的成本的特点。因此这一技术的实施和推广将对目前结核病的诊断和药敏检测产生巨大的推动作用。

2 MODS技术在结核病诊断中的研究和应用

2.1 MODS技术在肺结核诊断中的研究和应用

MODS技术由Caviedes等［3］在2000年首先报道。在该项研究中，Caviedes等系统比较了金胺O染色法、L－J法、7H11培养基培养法、分枝杆菌自动化培养系统、MODS技术和PCR技术对临床疑似结核病患者的痰标本的检测参数，结果显示，MODS技术的敏感性达到92%，显著高于金胺O染色法和固体培养基培养法（L－J法和7H11培养基培养法），与分枝杆菌自动化培养系统和PCR技术无显著性差异。同时，在所有的病原学检测方法中，MODS技术的检出时间最短（9天），且检测成本仅为分枝杆菌自动化培养系统检测成本的约十分之一。因此这一研究充分展示了MODS技术在结核病快速诊断中的价值。

随后，Moore等［4］开展的一系列大样本多中心的研究结果显示，MODS技术诊断结核病的阳性预测值和阴性预测值分别为97.0%和99.7%，而平均检出时间仅为6－8天，明显短于分枝杆菌自动化培养系统的10－16天和L－J法的21－33天，进一步肯定了MODS技术在结核病诊断中的重要价值。最近，不同学者分别在巴西、洪都拉斯、埃塞俄比亚、印度和厄瓜多尔等国家进行了MODS技术的应用研究，这些研究虽然在数据上有一些小的差异，但研究结果均支持MODS技术是一种敏感、可靠、快速和相对廉价的结核病病原学诊断技术，尤其适应于在经济相对落后的发展中国家推广应用［5－8］。

值得一提的是，Reddy和 Ha等［9，10］的研究显示，对于HIV感染合并结核病的这一类特殊人群的诊断，MODS技术同样具有很高的检测敏感性和特异性，同时能够满足快速诊断的要求。这些研究提示MODS技术可以作为一种在HIV感染者中诊断或排除肺结核有效的筛选方法，对于在HIV感染者中进行结核病预防性治疗措施的实施有重要的推动作用。

在国内，近期也有学者开展了一些MODS技术研究的有益探索，并取得了一些有价值的成果，但遗憾的是我国学者目前开展的研究多数是在实验室以分枝杆菌标准株进行的研究，尚未见有直接采用临床标本进行检测的研究报道［11－13］。

2.2 MODS技术在儿童结核病诊断中的研究和应用

由于痰标本留取困难等原因，儿童肺结核的病原学检测往往检出率很低，加之儿童结核病往往症状不典型，很容易造成漏诊和误诊。为提高儿童肺结核的诊断率，很多学者尝试采用其它的标本进行病原学检测，如鼻咽抽吸物、胃抽吸物和粪便等，但这些标本成份较痰标本更为复杂，且MTB所处的环境与痰中也有很大的区别。为验证MODS技术在这些标本中的诊断效能，探讨其在儿童结核病中的应用价值，Oberhelman等［14］分别采用抗酸染色法、MODS技术和L－J法对165例患儿留取的胃抽吸物、鼻咽抽吸物和粪便标本进行检测，结果表明，MODS技术的平均检出时间为10天，检测敏感性为86.8%，远高于L－J法的55.3%和抗酸染色法的39.5%。尤其值得一提的是，在抗酸染色阴性的患儿标本中，MODS技术的检测敏感性依然达到了82.6%。因此，该研究提示MODS技术同样适用于胃抽吸物、鼻咽抽吸物和粪便等标本的快速、高效检测。

最近，Ha、Oberhelman等［15，16］的一系列研究进一步肯定了MODS技术在儿童结核病诊断中的巨大优势，证实MODS技术可大大提高对儿童结核病的诊断效率。但另一方面，Graham等［17］的研究同时发现，在结核病高危组中，一些儿童虽然有明显的肺结核临床症状，但MODS检测结果却为阴性，且具体原因还不清楚，仍需进一步深入探讨。

2.3 MODS技术在肺外结核诊断中的研究和应用

肺外结核往往缺乏特异性的全身症状和影像学变化，局部症状也往往被其他症状掩盖，因此临床诊断较为困难，实验室诊断显得尤为重要。但常规方法如涂片镜检和固体培养基培养法等在肺外结核的诊断方面效果并不理想，因此寻找一种更为敏感和特异的肺外结核检测方法一直是临床医生和实验室研究人员的努力方向。Caws等［18］最先探讨了MODS技术在结核性脑膜炎中的诊断价值。在该研究中Caws等对230份临床疑似结核病脑膜炎患者的脑脊液标本进行了检测，结果显示MODS检测的敏感性为64.9%，显著高于抗酸染色法的52.6%，与分枝杆菌全自动培养系统和L－J法（均为70.2%）比较略低，但统计学分析显示差异并无显著性。Caws认为，该研究中MODS法敏感性稍差的主要原因可能在于检测过程中标本使用量上的差异。在MODS检测中，由于细胞培养板容量的限制，每检测孔的标本量只有100μl，而分枝杆菌全自动培养系统和L－J法接种的标本均为250μl，而病原学检测的敏感性与标本量的多少是直接相关的，若使用较大容量的培养板，其阳性率可能会进一步提高。此外，本研究的另一个有趣的发现是，与检测痰标本的检出时间相比，MODS检测脑脊液的平均检出时间更短，只需6天，这可能由于脑脊液标本无需进行前处理即可直接进行培养，而痰标本在培养前需经氢氧化钠和乙酰半胱氨酸进行预处理，而这种预处理可能对MTB的生长具有抑制作用。因此，这一研究提示MODS在结核性脑膜炎诊断中不仅具有有敏感、快速的特点，还具有操作简便和费用低廉的优点，对结核性脑膜炎的早期诊断具有重要价值。

此后，Tovar等［19］探讨了MODS技术在结核性胸膜炎中的诊断价值。研究发现，在对胸膜活检组织的检测中，MODS的敏感性达到81%，远高于L－J法的51%。虽然在胸水中的检测敏感性只有20%－40%（视标本的处理与否不同），但也远高于L－J法的6%－7%。同时，与在其他标本中一样，MODS的平均检出时间与L－J法相比有很大的缩短，显示MODS技术对结核性胸膜炎的诊断也具有很好的应用和推广价值。

3 MODS技术在MTB药敏检测中的研究和应用

耐药MTB的产生和流行是结核病化疗的巨大障碍。研究证实，由于经验性治疗的不合理用药是耐药性MTB产生的重要原因之一，反过来，随着耐药率的不断升高，经验性用药的弊端更加明显［20］。由于目前 WHO推荐的MABA法（microplate alamar blue assay）进行MTB的药敏分析需要采用MTB纯培养物进行检测，所需时间很长，临床往往无法等待药敏检测报告再作治疗，因此这一矛盾在广大的发展中国家仍难以克服，这也是目前耐药性结核病逐年升高的主要原因之一。MODS技术由于可采用临床原始标本直接进行药物敏感性分析，且培养时间较短，在MTB的药敏检测中表现出良好的应用潜力。

Caviedes等最先评价了MODS技术在检测MTB对利福平（RIF）和异烟肼（INH）耐药性中的价值［3］。研究显示，视采用的药物浓度不同，MODS技术对RIF和INH的药敏检测结果与金标准MABA的符合性为89%－100%，表现出极佳的可靠性，更为重要的是，药敏检测时间由MABA的3周（尚未计算得到纯培养物的标本培养时间）缩短至9.5天，大大缩短了药敏检测的时间，对临床合理选用治疗药物具有重要的意义。随后，Moore和Mello等［4，21］的研究均证实，MODS技术检测 MTB对RIF和INH敏感性的结果与金标准方法的符合率均在90%以上，得到药敏结果的中位时间由68天缩减到7天。这一系列的研究均提示MODS技术在分析MTB对RIF和INH的敏感性方面具有极佳的可靠性和推广应用价值。但在对另几种抗结核一线药物如乙胺丁醇（EMB）和链霉素（SM）的药敏检测中，不同的实验室得出的结论却存在较大差异，Moore等［4］的研究显示 MODS技术对EMB和SM的药敏检测结果与金标准方法的符合率均大于90%，但Caviedes等［3］的研究却显示只有51%－77%。这可能与不同研究小组采用的药物来源和浓度不同，以及MTB在不同地区的耐药谱存在差异有关。但大多数的研究均提示MODS技术对临床常用的抗结核药物的药敏分析结果具有很高的可靠性［22－27］。Minion等［28］最近进行的一项荟萃分析也支持这一观点。

4 MODS技术面临的挑战及展望

综上所述，MODS技术与现有的结核病病原学诊断方法相比，具有不可比拟的优点，适合于在发展中国家大力推广。但作为一种新兴技术，MODS技术同样存在一些不足，在推广应用之前尚面临一系列的挑战。其中，首当其冲的是如何实现MODS技术的标准化。目前，虽然已有大量的相关研究报道，但不同研究小组对标本去污剂的选择及去污处理方法、标本的最终接种量、药敏检测过程中的药物浓度选择等很多方面均缺乏统一，研究过程中采用的参照方法也各不相同，而这些差异都会直接影响到检测结果。因此，建立一个统一的标准对更为客观地评价MODS技术的效果，增强不同实验室之间的结果可比性方面具有重要意义。其次，MODS技术与分枝杆菌全自动培养系统一样，难以对培养出的细菌进行进一步的分类鉴定。再次，由于在检测过程中需频繁地取出培养板观察，MODS技术的操作安全性也不容忽视。

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