蛋白磷酸酶PHLPP与PI3K/Akt信号通路的研究进展

胡海峰 殷玥 马恒

蛋白磷酸酶PHLPP与PI3K/Akt信号通路的研究进展

胡海峰 殷玥 马恒

近年来有关肿瘤形成机制的研究发现，多数肿瘤细胞中促细胞生存基因Akt的活性升高，并且证实Akt激酶活性的平衡对细胞生长与凋亡具有重要的调节作用。如何抑制Akt活性随之成为抑制肿瘤生长研究的热点。2005年新发现的一种天然抗癌基因——PHLPP(PH domain Leucine－rich repeat Protein Phosphatase)能特异性地使Akt C末端的疏水基团去磷酸化，降低Akt的活性和表达水平，从而抑制肿瘤的生长。这为抗肿瘤药物的研制提供了新的方向，PHLPP的研究也日益受到重视。现将PHLPP与PI3K/Akt信号通路的研究进展综述如下。

PI3K; Akt; PHLPP; 抗癌基因; 肿瘤; 综述

Akt/蛋白激酶B(PKB)即丝/羟丁氨酸蛋白激酶，作为磷脂酰肌醇激酶－3(PI3K)的一个靶分子被发现至今已有十余年［1］。Akt基因所表达的蛋白激酶，可被PI3K磷酸化激活。生理状态下，PI3K/Akt信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用。但是，如Akt基因表达异常增高时，则导致细胞生长与凋亡失衡，不仅可使正常细胞生长分裂加速，并且可抑制细胞凋亡，从而参与肿瘤生成，与人类多种肿瘤的发生、发展密切相关。研究表明，该信号通路在人类大多数恶性肿瘤中都出现异常，在肿瘤的增殖、存活和抵抗凋亡、血管发生以及细胞运动中发挥了重要作用。

2005年由美国加州大学圣地亚哥分校医学院药理学系的科研人员在人体中发现的PHLPP基因位于人体18号和16号染色体上，它所编码的PHLPP蛋白为蛋白磷酸酶，其生理作用是特异性地将磷酸化激活的Akt脱磷酸化而失去蛋白激酶活性，从而抑制Akt的促细胞生长作用。而且，PHLPP在人体各组织器官及细胞中均有广泛表达。通过对人体多种肿瘤细胞进行分子和生化分析，发现某些肿瘤(如结肠癌)细胞中PHLPP水平显著降低，而Akt的磷酸化水平明显升高。提示，PHLPP可能参与肿瘤生长的负性调节。因此，PHLPP作为肿瘤抑制因子将可能用于所有与Akt水平升高的有关癌症的治疗。

1 PI3K/Akt信号转导通路的组成及其功能

1.1 PI3K的结构和功能 由Whitman M等首先发现的磷脂酰肌醇－3－激酶(phosphoinositide 3－kinase，PI3K)是参与细胞内信号转导的信号分子之一。根据其作用底物的不同，PI3K一般被分为Ⅰ型(ⅠA型，ⅠB型)、Ⅱ型、Ⅲ型3个亚型［2］。Ⅰ型PI3K在细胞内主要磷酸化 PI－4，5－P2，此酶的产物主要是磷脂酰肌醇－3，4，5－三磷酸。Ⅱ型PI3K主要能磷酸化PI及PI4P;Ⅲ型PI3K仅能磷酸化PI，生成PI3P。以上三种PI3K除磷脂酶活性外，Ⅰ、Ⅲ型还具有内源性蛋白激酶活性，可使其自身或调节蛋白磷酸化，进而影响磷脂激酶的活性。

PI3K含有85KD的调节亚单位和110KD的催化亚单位组成的异二聚体，是Akt活化的首要调节者。其调节亚基P85分子由以下几个结构域构成:SH3区域、2个富含脯氨酸的区域和2个Src同源结构域。该非编码区是P85和P110相互作用的区域，2个SH2结构域是PI3K与受体酪氨酸激酶结合的区域，通过与磷酸化的酪氨酸残基结合来传导酪氨酸信号［3］。在生长因子、胰岛素或受体酪氨酸激酶(PTK)的相互作用下，PI3K的P85调节亚单位募集P110催化亚单位到细胞膜。而P110通过使磷脂酰肌醇肌醇环上的D－3位点磷酸化而产生第二信使作用。PI3P水平受PTEN等磷酸酶的调控。值得注意的是，PI3P并不能直接活化Akt，而是使Akt聚集到细胞膜，从而发生构象变化，使其得以被PDK－1磷酸化，引起后续的细胞内信号传导过程［4］。

1.2 Akt的结构和功能 Akt是由于其与蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)及蛋白激酶C(protein kinase C)有很高的同源性。目前发现Akt共有AktⅠ、AktⅡ、AktⅢ3种亚型，三者之间有很高的同源性。但表达水平不同，AktⅠ在组织中广泛表达;AktⅡ主要存在于胰岛素效应组织，如心肌、骨骼肌等;AktⅢ高表达于睾丸和脑组织中。Akt结构由三部分组成:位于氨基端的PH结构域、中间催化域和位于羧基端的调节域。Akt激活的主要机制是磷酸化，其调节主要依赖于PI3K－磷酸肌醇依赖性激酶(PDK)信号通路。Akt的催化域和调节域具有Thr308和Ser473两个磷酸化位点，只有两个位点同时磷酸化才能使Akt充分活化从而达到最大活化状态。Akt在PI3K受到细胞外胰岛素及胰岛素样生长因子等的作用下激活并在细胞膜产生的PIP2的作用下产生同二聚体并达到部分激活的状态，进而Akt/PKB转位到细胞膜，使Akt/PKB本身获得催化活性，催化其自身的Ser124和Thr450磷酸化，并且使Akt/PKB和PDK－1通过它们的PH结构域与Ptdlns(3，4，5)P3直接结合锚定在细胞膜上，这样PDK－1就能催化Akt/PKB的Ser473和Thr308磷酸化，使Akt/PKB完全活化。活化的Akt由细胞膜释放入胞引起信号转导的级联反应过程［5］。

2 PI3K/Akt信号通路与肿瘤

Akt是PI3K/Akt信号通路的关键分子，活化的Akt通过调节下游多种信号途径而发挥促细胞生存抑制细胞凋亡等作用。近年来，关于Akt的异常激活与肿瘤的发生、发展的研究取得了重大进展。

2.1 抑制细胞凋亡

2.1.1 Bad Bad是Bcl－2家族成员之一，主要分布于线粒体外膜。Bad是第一个被发现的Akt下游靶分子，在细胞凋亡的调控上发挥重要作用。Bad可与Bcl－2或Bcl－xL形成复合体促细胞凋亡，当Akt将Bad的Ser136位点磷酸化，即引起Bad与伴侣蛋白(Chaperone)14－3－3结合，从而阻断Bad与Bcl－2或Bcl－xL形成二聚体，使Bad不能发挥促细胞凋亡作用。同样也有研究表明，Akt也能将Bcl－2家族成员Bax的Ser184位点磷酸化，使Bax停留在细胞质中，促进它和Mcl－1、Bcl－xL形成异源二聚体，因此抑制凋亡。

2.1.2 caspase－9 在细胞凋亡中，caspase－9前体能与Apaf－1等蛋白结合而自我激活，从而启动天冬氨酸蛋白水解酶级联反应。Akt可将caspase－9前体的Ser196位点磷酸化，抑制其蛋白酶活性，阻止其促凋亡作用。相应的，若细胞中caspase－9前体的Ser196位点发生突变，Akt对caspase－9的抑制作用消失。

2.1.3 FKHR1 有报道，Akt也可通过Forkhead家族转录因子如Forkhead受体、FKHR等调节促细胞死亡基因转录。研究证实，在没有Akt作用下，Forkhead家族主要定位于核内，通过结合到特异顺式作用元件促进Fas－L、IGFBP1和Bim等凋亡相关基因的转录。在生长因子刺激下，Akt可将Forkhead家族转录因子磷酸化，改变其胞内定位。在Akt作用后，FKHRL1从核内移出，被14－3－3蛋白隔离在胞质区并在此堆积，从而阻止其发挥调节凋亡相关基因转录功能［6～8］。

2.2 促进细胞周期进展 Akt通过增加c－myc的转录，上调该基因的表达，这是最早明确由Akt直接作用影响细胞周期的是抑癌基因［9］。当c－myc过度活化或过度表达时，是一种较强的细胞周期促进因子，它通过使细胞逃离G0期而引起细胞增殖。后来研究发现，Akt还可以作用于多种细胞周期调控因子，如 Cyclin D1、p21、Mdm2、mTOR 等，通过多种途径促进细胞周期的进展。Akt作用于GSK－3，引起由GSK－3介导的Cyclin D1降解，致使其半衰期很短，从而延长G1期;Akt可以磷酸化p21，使其移位到胞质，丧失抑制作用，从而促进细胞周期进展;Akt还能结合Mdm2并磷酸化其Ser166、186位点，诱导核输入或上调泛素连接酶的活性，进而促进 p53的失活或降解，阻断 p53介导的促凋亡转录反应［10］。

2.3 促进细胞侵袭和转移 Akt磷酸化激活后能够增加转录因子NF－KB的转录活性，使MMP－9产量增加，且细胞运动增强，有助于癌细胞侵袭，NF－KB还能上调COX－2的表达，促进细胞侵袭的发生;Akt也可经过mTOR/p70s6k途径促进肌动蛋白的细丝重构，促进细胞运动。有研究表明，用持续活化的Akt转染的鳞状上皮细胞癌细胞株，Akt可诱导上皮间叶细胞转换，细胞转而获得纤维原细胞样特性，而且E－钙黏素的转录下调，有效减少细胞间的黏附，增加了细胞的运动性和侵袭性［11，12］。

3 PI3K/Akt信号通路的负调控

近年来研究发现，细胞内存在蛋白磷酸酶2A(PP2A)、钙调蛋白磷酸酶(PP2B)以及肿瘤抑制因子PTEN等多种信号分子能够使Akt去磷酸化。PP2A和PP2B的底物特异性低，而PTEN是通过脱磷酸化Akt的上游调节酶PI3P来实现对Akt活化的抑制。但是，多数实验发现，某些细胞，如LN229细胞对PI3K、PTEN并不敏感。另一方面，仅应用PTEN来阻止PI3K－PI3P途径，只能在上游部分抑制Akt的活化，不能抑制已经活化的Akt，例如，2005年由Sarbassov等报道，哺乳动物中一种Rapamycin不敏感的蛋白激酶复合物也能够磷酸化Akt的Ser473。上述情况降低了PTEN等蛋白磷酸酶在肿瘤抑制等方面的应用［13］，寻找Akt特异的蛋白磷酸酶及其负性调控因子对于肿瘤的生长调控具有重要意义。

4 PHLPP的结构和功能

4.1 PHLPP的结构 PHLPP家族有三种磷酸酶亚型:PHLPP1－α、PHLPP1－β和 PHLPP2。PHLPP1－α和PHLPP1－β是由位于18号染色体上的同一基因(18q21.33)表达的不同亚型，而编码PHLPP2的基因位于16号染色体上(16q22.3)。PHLPP1－β比PHLPP1－α在N末端多出一个大约56KD的区域，这两个亚型在对Akt信号通路的调控上发挥着不同的作用。PHLPP1和PHLPP2在PH结构域之后都含有一个亮氨酸重复基序(LRR)，另外均含有一个PP2C磷酸酶结构域和C末端的PDZ结合区［14］。此外，PHLPP1－β和PHLPP2在PH结构域前还有一个Ras结合区(RA结构域)。PHLPP1和PHLPP2在PH结构域和PP2C磷酸酶结构域中分别存在63%和58%相同的氨基酸基序。

4.2 PHLPP的表达 研究表明，PHLPP1和PHLPP2均可广泛表达于细胞质、细胞核和部分膜结构上，在人体的大部分组织器官中都有表达。但在肿瘤细胞(如乳腺癌细胞)中，PHLPP的表达水平却明显降低。此外，编码PHLPP2的基因跨越了两个染色体脆性部位，这些区域是染色体容易发生突变或断裂的地方，因此肿瘤细胞中常表达结构异常的PHLPP2。

4.3 PHLPP对其作用靶点的调控作用

4.3.1 PHLPP对Akt的去磷酸化作用 Akt的三个亚型的完全活化需要Thr308和Ser473两个位点磷酸化，才能使其得以到胞浆内引起信号转导通路的级联反应，从而发挥其调控细胞周期、抑制细胞凋亡、促进肿瘤发生的作用。而PHLPP则可以特异地使细胞中Akt的疏水基团去磷酸化，从而导致活化的Akt水平降低，发挥促进细胞凋亡和抑制细胞增殖的作用。实验表明，PHLPP1在裸鼠恶性胶质瘤细胞中的大量表达，可以使肿瘤缩小，但是敲除PHLPP1上的PDZ结合区之后，PHLPP的这种抑瘤作用便会丧失，因此PHLPP生物效应的发挥依赖于PHLPP上的PDZ结合区。实验表明，PHLPP1和PHLPP2均可以抑制活化的Akt表达的水平和时间，但是缺失两者中任意一个，正常乳腺细胞中磷酸化的Akt水平就会上升30%。敲除内源性的PHLPP1、PHLPP2基因后，不仅会使相同的Akt信号通路底物分子(如GSK－3b、TSC－2、p27)的磷酸化水平升高，而且会导致一些少见的Akt信号通路底物分子(如E3连接酶、HDM2、GSK－3a)的磷酸化水平升高［14］。

实验研究还发现，PHLPP1和PHLPP2对于Akt信号通路的微调节发挥着不同的调控作用。PHLPP1主要使AktⅡ和AktⅢ去磷酸化，而PHLPP2则影响AktⅠ和AktⅢ的磷酸化。除此之外，细胞中含有明确的PHLPP－Akt－底物作用路径，如PHLPP1－Akt2－HDM2和PHLPP2－Akt3－p27。然而PHLPP1和PHLPP2的抑瘤功能的强弱是有差别的，PHLPP2的抑瘤作用强于PHLPP1。敲除PHLPP1可使细胞G1/S率的水平降低25%，而敲除PHLPP2可使细胞G1/S率的水平降低50%［15］。总之，PHLPP1和PHLPP2在使磷酸化的 Akt去磷酸化过程中发挥重要作用，两者相辅相成，缺一不可，共同发挥着抑瘤的重要作用。

4.3.2 PHLPP对PKC的去磷酸化作用 PKC是促肿瘤佛波酯的受体，是与肿瘤发生密切相关的一种蛋白激酶。1995年，在PKCβⅡ和p70S6激酶中发现PKC分子中含有一个疏水基团。此疏水基团的磷酸化控制着细胞中活化的PKC的水平从而调控PKC信号通路的强度。PHLPP1和PHLPP2均可以使传统的或新的PKC分子中的疏水基团去磷酸化，但是对于非典型的PKC毫无作用，因为这些非传统的PKC在此位置有一个谷氨酸。PHLPP的这种去磷酸化作用降低了PKC的水平，在PHLPP敲除细胞中，PKC的水平明显增加。研究还发现，在mTORC2复合物缺陷的细胞中，其PKC疏水基团的磷酸化水平降低，这表明此复合物促进PKC的磷酸化。虽然这个机制并未阐明，但是可以明确的是PHLPP对mTORC2复合物具有拮抗作用［16］。因此推断PHLPP还通过使PKC去磷酸化而发挥抑瘤作用。

5 PHLPP在疾病中的潜在作用

5.1 肿瘤 PHLPP1和PHLPP2通过使磷酸化的Akt去磷酸化，补充PTEN功能的不足，降低细胞内活化的Akt水平，从而抑制PI3K/Akt信号通路的调控细胞周期、抑制细胞凋亡、促进肿瘤发生的作用。通过对人体多种肿瘤细胞进行分子和生化分析，发现某些肿瘤(如乳腺癌、结肠癌)细胞中PHLPP水平显著降低，而Akt的磷酸化水平明显升高。因此，推断PHLPP作为肿瘤抑制因子将可能用于与Akt水平升高的有关癌症的治疗。此外，PHLPP还可以使PKC去磷酸化而发挥抑瘤作用。这些均为研制抗肿瘤药物提供了新的研究方向。

5.2 糖尿病 Akt信号通路是胰岛素在细胞内的主要效应通路，促进细胞对葡萄糖的摄取。Akt通过促进葡萄糖载体Glut4易位，从而促进葡萄糖的跨膜摄取。Cozzone等在Ⅱ型糖尿病患者的骨骼肌肌管中发现，Akt2的Ser473位点磷酸化水平降低，Akt1的Thr308位点的磷酸化水平降低。此外，他们还观察到Ⅱ型糖尿病患者的细胞中编码PHLPP1的mRNA的表达水平上调。而PHLPP－1恰好能使Akt2的Ser473磷酸化位点去磷酸化［17］。因此推测抑制细胞中PHLPP－1的表达，可以提高Akt磷酸化的水平，调节胰岛素敏感性。从而促进细胞对葡萄糖的摄取作用，降低血糖，达到一定的治疗糖尿病的效果。

5.3 脑缺血再灌注损伤 来自临床研究的结果显示，脑内Akt会在脑缺血再灌注损伤3～12 h后激活，并且缺血损伤半影区的脑组织中Ser2473磷酸化Akt的表达显著增强，主要以星形胶质细胞为主，而损伤中心脑区中的Akt却只有微弱的激活。研究发现，利用Akt的激动剂，脑缺血再灌注后上调Akt的激酶活性能有效抑制神经元的死亡［18］。因此推断，利用药物抑制缺血再灌注损伤脑组织中的PHLPP的活性，以此提高损伤脑组织中Akt的激活程度，将有利于神经元的存活，抑制神经元损伤。

5.4 冠状动脉支架置入术后再狭窄(RS) 冠状动脉支架置入术后再狭窄是困扰临床冠心病救治效果的严重问题。在众多导致RS的因素中，血管平滑肌细胞(VSMC)过度增生、血管内皮功能损害等是RS发生发展的重要因素。有学者提出，PTEN转基因治疗抑制VSMC增生，对预防RS具有一定效果。但是，因PTEN仅能从上游途径抑制Akt的活化，不能抑制已经活化的Akt，并且PTEN转基因也损害内皮细胞的正常生长。这些限制严重制约了PTEN在防治RS中的应用。而磷酸酶PHLPP在防治RS的研究中显示出巨大潜力，它可以特异性地将磷酸化Akt发生去磷酸化失活。更为重要的是，PHLPP在内皮细胞HUVEC中无表达，并且转基因研究发现其对HUVEC生长无抑制作用。这显示出了PHLPP在内皮细胞和VSMC中存在截然不同的信号转导机制。PHLPP对内皮细胞和VSMC的选择性调节，使人们可能通过PHLPP转基因治疗来实现新的RS防治策略，即:在抑制VSMC过度增生的同时又不影响内皮细胞再生和支架内皮化进程。这是目前其他目的基因治疗所难以回避的难题［19］。

6 展望

PHLPP 从2005年被发现以来，就一直备受关注，有关PHLPP的研究也不胜枚举，但是仍然有许多问题尚待解决。比如，如何用药物激活PHLPP从而达到抑制肿瘤的效果?激活PHLPP后对其他器官功能的影响如何?怎样调控不同组织中PHLPP的水平来治疗不同的疾病?这些都需要更深入的研究。相信随着对于PHLPP的深入研究，一定会带给癌症、糖尿病等疾病的患者更多的福音。

［1］Franke TF，Yang SI，Chan TO，et al．The protein kinase encoded by the Akt proto－oncogene is a target of the PDGF2 activated phosphate idylinositol 32 kinase［J］．Cell，1995，81(5):727 －736．

［2］Yong Liao，Mien － Chie Hung．Review Article Physiological regulation of Akt activity and stability［J］．Am J Transl Res，2010，2(1):19－42．

［3］Vanhaesebroeck B，Leevers SJ，Ahmadi K，et al，Synthesis and function of 3 － phosphorylated inositol lipids［J］．Annu Rev Biochem，2001，70:535 －602．

［4］Wymann MP，Pirola L．Structure and function of phosphoinositide 3 －kinase［J］．Biochim Biophys Acta，1998，1436:127 －150．

［5］常盛．PI3K/Akt信号通路与胰岛素抵抗的研究进展［J］．中医药导报，2008，14(7):113 －115．

［6］Niquet J，Wasterlain CG．Bim，Bad，and Bax:a deadly combination in epileptic seizures［J］．J Clin Invest，2004，113(7):960 －962．

［7］Xin M，Deng X．Nicotine inactivation of the proapoptotic function of Bax through phosphorylation［J］．J Biol Chem，2005，280(11):10781－10789．

［8］Cardone，MH，Roy N，Stennicke HR，et al．Regulation of cell death protease caspase － 9 by phosphorylation［J］．Science，1998，282(5392):1318－1321．

［9］Ahmed NN，Grimes HL，Bellacesa A，et al．Transduction of interleukin－2 antiapoptotic and proliferative signals via Akt protein kinase［J］．Proc NatI Acad Sci USA，1997，94(8):3627 －3632．

［10］Wee KB，Aguda BD．Akt versus p53 in a network of oncogenes and tumor suppressor genes regulating cell survival and death［J］．Biophysics J，2006，91(3):857 －865．

［11］Qian Y，Corum L，Meng Q，et al．PBK induced actin filament remodeling through Akt and p70S6K1:implication of essential role in cell migration［J］．Am J Physiology Cell Physic，2004，286(1):C 153 －C163．

［12］Grille SJ，Bellacosa A，Upson J，et al．The protein kinase Akt induces epithelial mesenchymal transition and promotes enhanced motility and invasiveness of squamous cell carcinoma lines［J］．Cancer Res，2003，63(9):2172 －2178．

［13］吴兴利，刘文静，杨丁友，等．胰岛素样生长因子－1对血管平滑肌细胞磷酸酶PHLPP蛋白表达的影响［J］．实用医学杂志，2010，26(4):552 －554．

［14］Brognard J．PHLPP and a second isoform，PHLPP2，differentially attenuate the amplitude of Akt signaling by regulating distinct Akt isoforms［J］．Mol Cell，2007，25:917 －931．

［15］Brognard JE，Sierecki T，Gao，et al．PHLPP and a second isoform，PHLPP2，differentially attenuate the amplitude of Akt signaling by regulating distinct Akt isoforms［J］．Mol Cell，2007，25(6):917－931．

［16］Gao，T．The phosphatase PHLPP controls the cellular levels of protein kinase C［J］．Biol Chem，2008，283:6300 － 6311．

［17］Cozzone DS，Frojdo E，Disse，et al．Isoform － specific defects of insulin stimulation of Akt/protein kinase B(PKB)in skeletal muscle cells from type 2 diabetic patients［J］．Diabetologia，2008，51(3):512－521．

［18］Choi JS，Park HJ，Kim HY，et al．Phosphorylation of PTEN and Akt in astrocytes of the rat hippocampus following transient forebrain ischemia［J］．Cell Tissue Res，2005，319(3):359 －366．

［19］吴兴利，杨丁友，颜伟，等．磷酸酶PHLPP1转基因对人脐静脉内皮细胞增殖的影响［J］．南方医科大学学报，2010，30(6):1298－1300．

10.3969/j.issn.1674－4985.2012.02.102

710032第四军医大学

马恒

2011－10－12)

(本文编辑:陈丹云)