阿片类受体亚型间相互作用研究进展

伊首璞，陈忠明，张继虹，张宽仁

(昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明 650500)

阿片类受体(opioid receptors)是G蛋白偶联受体(GPCR)超家族的一员，参与镇痛、抑制肠胃蠕动、呼吸抑制、心肌保护、免疫反应等多种生理活动。一般认为阿片受体可以分为4种亚型:μ阿片受体(mu opioid receptor，MOR)、δ 阿片受体(delta opioid receptor，DOR)、κ 阿片受体(kappa opioid receptor，KOR)和阿片样受体-1(opioid receptor like-1，ORL-1;又称 orphanin receptor孤啡肽受体/nociceptin receptor痛敏素受体)。一直以来，阿片类镇痛剂在临床镇痛，尤其是重度疼痛和晚期癌症患者的治疗中发挥着不可替代的作用，但易引起呼吸抑制等严重副作用，长期使用会产生便秘、药物耐受及成瘾性。为了能够设计出镇痛活性高、副作用少甚至没有副作用的新型镇痛药，几十年来人们对阿片镇痛和耐受成瘾的分子药理机制做了大量的研究，但仍有许多问题尚未阐明［1］，因此，以分子药理作用机制为基础，开发高效低毒的镇痛剂仍是目前迫切需要解决的科学难题。

基于对阿片类受体各亚型结构与功能认识，在阿片类镇痛剂开发过程中，最初认为针对单一阿片受体的高选择性配体会有高活性低毒副作用。然而，更多研究发现，高选择性激动剂反而会增强副作用［2］，因此这类激动剂无法成为临床需要的高效低毒的新型镇痛剂。近年越来越多的研究表明，不同亚型的阿片受体之间存在不同程度的结构或(和)功能上的相互作用，共同参与镇痛等生理活动。如DOR激动剂不仅能增强MOR的镇痛效果，并且能减弱阿片类药物的呼吸抑制等副作用［3］，而KOR激动剂具有抗MOR介导的精神依赖成瘾作用［4］。同时免疫共沉淀等方法发现，在体内或某些离体细胞内，阿片受体间会发生二聚化或多聚化，使受体结构及其介导的信号传导途径发生了变化［5］。这些研究发现为阿片受体的作用机制研究提供了新的方向，同时也为开发能同时作用不同受体，高效低毒的镇痛药物提供了新的思路。

本文总结了阿片受体亚型间相互作用的最新研究进展，概述了同时作用于不同阿片受体的化合物的种类及其药理活性，并对该类药物可能的发展前景进行了展望。

1 μ阿片受体(MOR)与κ阿片受体(KOR)间的相互作用

目前临床上使用的阿片类镇痛剂主要MOR激动剂，但是长期使用该类药物会造成镇痛耐受，依赖和成瘾等严重副作用。研究发现，有些KOR激动剂能减弱或抑制MOR激动剂(如吗啡)导致的许多副作用，如耐受和依赖等［4］。其作用机制目前尚不清楚，但近来 Li等［6］用实时 PCR(RTPCR)、免疫组化技术和蛋白印迹法研究了慢性吗啡处理后小鼠不同神经区域的KOR变化，发现脊髓和蓝斑中KOR数量明显增加，从而定位了耐受小鼠体内KOR与MOR相互作用的可能区域，为进一步研究作用机制缩小了范围。Fujita-Hamabe等［7］证实，KOR可以抑制MOR的脱敏，加速 MOR细胞内循环使表面受体增加，同时还能够降低PKC(protein kinase C)的活性，从而抑制吗啡的镇痛耐受。

最近有研究发现MOR与KOR的相互作用也会影响镇痛作用。Shu等［8］研究阿片受体部分激动剂喷他佐辛(pentazocine)时发现其镇痛作用具有剂量上限，当超过一定剂量时，镇痛作用会减弱。他们认为，这是由于MOR/KOR共同作用的结果。小鼠实验证实，低剂量喷他佐辛的镇痛作用会被选择性MOR拮抗剂C-CAM(clocinnamox)完全抑制，而C-CAM只部分抑制高剂量喷他佐辛的镇痛作用。选择性KOR拮抗剂nor-BNI能增强高剂量喷他佐辛的镇痛作用，而同时使用C-CAM和nor-BNI能完全抑制喷他佐辛在任何剂量时的镇痛作用。由此推断，低剂量的喷他佐辛只与MOR作用，而高剂量的喷他佐辛会与MOR、KOR同时作用，并且KOR会抑制其镇痛作用。

Liu等［9］发现MOR和KOR的相互作用有性别差异，他们用免疫共沉淀法研究发现，发情期的♀鼠脊髓中MOR/KOR二聚体的数量是♂鼠的4倍，发情期♀鼠中MOR/KOR二聚体的数量是非发情期♀鼠的3倍，用KOR拮抗剂阻断KOR功能后发现脊髓注射吗啡镇痛作用明显下降，而甩尾实验证明，单独使用KOR激动剂不能产生明显的镇痛效果，提示KOR在♀动物的脊髓吗啡镇痛中会与MOR联合发挥作用。

2 μ阿片受体(MOR)与δ阿片受体(DOR)间的相互作用

有研究表明DOR不仅能增强MOR的镇痛效果，而且能减弱其呼吸抑制作用，对抗其肌肉僵直作用及身体依赖等副作用［3］。Gomes等［10］发现，在 MOR，DOR 共表达的细胞内，DOR激动剂DeltorphinⅡ、拮抗剂TIPPψ、naltriben等都可以加强吗啡或DAMGO等MOR激动剂与MOR的结合，并能增强它们激活 G蛋白的活性。Beaudry等［11］认为，MOR和DOR在脊髓神经元中可共表达，并能共同抑制P物质的释放，从而增强镇痛作用。Jodeph和 Levine［12］进一步研究发现，DOR激动剂SNC80和MOR激动剂DAMGO都能够抑制神经生长因子(NGF)诱导的痛觉过敏，两种激动剂联合使用时，抑制小鼠体内痛敏感受器(nociceptors)调节的痛觉过敏(hyperalgesia)，明显加强镇痛作用。但长期使用DAMGO增加自身耐受性的同时也能够导致SNC80的镇痛效果减弱，即产生交叉耐药性(cross-tolerance)，说明MOR和DOR共同调节酪氨酸激酶类痛敏感受器的功能。

MOR与DOR的相互作用对减弱长期使用吗啡类药物产生的镇痛耐受和成瘾性也有明显效果。研究证实，与吗啡相比，混合型的MOR激动剂/DOR拮抗剂化合物可以明显减弱耐受和成瘾作用，而DOR拮抗剂如纳曲吲哚(naltrindole)能够减弱吗啡的耐受，DOR基因敲出小鼠的吗啡耐受性也明显减弱［13］。Billa等［14］用 DOR2拮抗剂 naltriben 处理小鼠海马体，发现naltriben可以破坏吗啡引起的小鼠条件性位置偏爱。亚细胞分级技术表明，naltriben处理后，海马突触细胞后膜中DOR二聚体的的表达量明显增加，MOR的表达量也同样增加。提示成瘾性与海马组织中MOR/DOR相互作用也有关。

两种受体间的相互作用机制仍未完全阐明。但近年来许多研究证明，MOR和DOR相互作用机制与二者能形成二聚体或多聚体有密切关系［15］。阿片受体被激动剂激活后，会迅速的被G蛋白偶联受体激酶(GRKs)磷酸化，然后与β抑制蛋白(β-arrestin)结合发生内吞作用，不同的阿片受体内吞后的去向不同，一般来说内吞后的DOR会在溶酶体中降解，而大部分MOR会经过循环再次回到细胞膜上［16］。但Milan-Lobo等［17］研究发现，用MOR激动剂美沙酮或DAMGO处理MOR、DOR共表达的HEK293细胞，会引起MOR、DOR形成二聚体并共同发生内吞作用，但与MOR单独内吞后能够循环再利用不同，美沙酮引起的DOR/MOR二聚体内吞后会降解。进一步研究发现，DOR选择性拮抗剂naltriben(NTB)能够阻碍美沙酮和DAMGO诱导的二聚体内吞作用，但NTB对美沙酮引起的胞内Ga2+释放没有明显影响。Golebiewska等［18］利用荧光共振能量转移法(FRET)、荧光相联能谱法(FCS)等研究两种神经细胞系中长期吗啡处理对MOR的影响时也发现，吗啡处理对单独MOR的扩散影响很小。而在DOR存在时，吗啡处理会明显提高荧光标记的MOR的扩散率。数量和亮度测定暗示MOR可能是以二聚体形式存在，并且能够与DOR寡聚化为四聚体，吗啡处理促进四聚体的解离，增加MOR的内化。He等［19］用一种包含MOR第一横跨膜域的干涉肽处理能减弱DOR的这种影响。这种干涉肽能与DOR作用，从而破坏MOR/DOR相互作用。并且，用包含MOR TM1结构域和C端TAT结构的融合蛋白能够破坏小鼠脊髓中MOR/DOR的相互作用，增强吗啡镇痛作用，同时减少吗啡的镇痛耐受，这同样说明MOR与DOR的二聚化与相互作用有密切关系。

3 δ阿片受体(DOR)与κ阿片受体(KOR)间的相互作用

DOR与KOR相互作用研究较少，但已经证实DOR和KOR可能在不同的表达体系中形成二聚体［20］。Waldhoer等［21］用一种特殊的阿片激动剂 6’-GNTI(6’-guanidinonaltrindole，它对DOR无激活作用，与单独的KOR结合只有很弱激活作用，但对DOR/KOR二聚体却有强效激活作用)研究KOR和DOR的二聚体，结果显示只有在脊髓神经细胞中6’-GNTI才有明显的镇痛作用，而在大脑神经元中作用不明显，提示DOR和KOR的二聚化有区域选择性。另有研究发现，外周痛敏感受器中的DOR在正常情况下对其激动剂无应答，只有在受到伤害或发生炎症时，DOR激动剂才能发挥镇痛作用［22］。Rowan等［23］用免疫共沉淀法证实，外周神经细胞中，KOR和DOR可以发生共聚，进一步研究发现 6’-GNTI在正常情况下不会改变神经元中前列腺素E2激活cAMP的水平，但在用炎性物质如缓激肽预处理后的神经元中，6’-GNTI能明显抑制前列腺素E2对cAMP的激活作用，说明在外周神经细胞中KOR与DOR在特殊情况下(受到伤害或发生炎症时)会以共聚体的形式发挥作用。

4 ORL1与其他阿片受体间相互作用

阿片样受体(ORL1)与经典的阿片类受体(mu、delta、kappa阿片受体)同源性很高，其内源性配体为孤啡肽(orphanin FQ，OFQ)或痛敏肽 (nociceptin，NOP)。ORL1与大多数已知的阿片受体配基亲和力都很低，但较早的研究发现，孤啡肽能拮抗全身应用吗啡的镇痛作用，也能拮抗阿片介导的应激性镇痛及MOR，DOR，KOR介导的镇痛［24］。2009年，Khroyan等［25］发现选择性ORL1拮抗剂SB-612111能加强丁丙诺啡(BuprenorPhine)等MOR/ORL1混合激动剂的镇痛作用。对ORL1基因敲除小鼠模型的研究发现其对吗啡耐受表现为部分丧失，并且对吗啡依赖性也明显降低［26］，提示ORL1与其他阿片受体会发生相互作用。近年来的报道已经证实:在许多涉及痛觉调节中枢神经元内，ORL1会与经典的阿片受体共表达［27］。Wen等［28］采用免疫荧光和免疫共沉淀的方法研究发现，在原代培养的海马和皮质神经元上，KOR和ORL1的免疫荧光在细胞膜上有重叠。同样，在HAKOR(Hemaglutinin标记的KOR)和Myc-ORL1共同瞬时转染的CHO和HEK293细胞上也有类似的发现，表明在这两种细胞中KOR和ORL1受体之间存在着异源二聚体。Evans等［27］发现在转染的tsA-201细胞和大鼠的脊髓背根神经节上，ORL1受体和其他阿片受体亚型均可以形成二聚体，并且用其他亚型受体选择性激动剂处理后都能发生共同内化作用(co-internalization)。同时他们还发现，ORL1会与MOR共同调节N型钙离子通道的内化，在脊髓镇痛中联合发挥作用。另有研究发现，ORL1能够调节MOR介导的阿片类药物突然停药后造成的严重撤药反应:ORL1激动剂OFQ/N对离体豚鼠回肠产生的吗啡撤药痉挛反应发挥着双重作用:低剂量时，OFQ/N能抑制痉挛，此时ORL1表现出阿片样受体性质，然而大剂量的OFQ/N却能增强撤药痉挛，此时表现出抗阿片行为［29］。

5 新型镇痛药物研发的现状及展望

基于不同受体间相互作用会产生镇痛效果增强、耐受和依赖性减弱等效应的事实，人们开始把研发高镇痛活性，低副作用镇痛药的注意力移到了设计能同时作用于两种或多种阿片受体的化合物上［30－31］。目前报道较多的是针对两种受体亚型的化合物，生理及药理学研究表明:有些化合物能够明显增强镇痛效果，如MOR/KOR的共同激动剂MCL-114、MCL-193等;有些化合物则能够明显减少副作用，如MOR和DOR双重激动剂LP1，研究发现LP1的镇痛效果与吗啡相似，但耐受性明显降低［31－32］。然而，目前报道的具有二重作用的化合物仅能部分消除副作用，临床应用价值不高。值得我们思考的是:生物体内不同的阿片受体亚型都有内源性肽类配体，这些配体或作用专一或能同时作用于不同的受体亚型，并通过精细的调控机制发挥生理功能，但几乎没有自身耐受和成瘾性等作用的报道。这一复杂的生理学作用机制虽然难以阐明，但这给我们一个启示——是不是高效低毒的镇痛药物应该同时与各受体亚型相互作用，且亲和力和作用方式(激动或拮抗)存在差异，从而使各种受体处于相互协调的状态，平稳和谐的发挥作用?

Chang等［33］是delta受体激动剂BW373的发现者，阿片类药物研发的资深专家。于2003年发明的一种同时作用于δ/μ/κ受体的激动剂——DPI-3290，在美国进入 II期临床试验。试验结果发现，其镇痛作用强度介于吗啡与芬太尼之间，呼吸抑制作用和身体依赖成瘾性较吗啡均成倍减弱，医疗安全系数较大程度的提高［34］。并报导了另外二个类似物DPI-125及DPI-130，它们也是δ/μ/κ受体混合型的激动剂，与吗啡、芬太尼相比，具有呼吸抑制作用的医疗安全系数较高的药理作用［35］。这一研究成果为上述启示提供了重要的依据，并为将来我们继续对作用于3种或3种以上阿片类受体的化合物深入研究指明了方向。尽管这类化合物的药理学机制及在体内的代谢过程还不清楚，但随着受体相互作用机制的阐明，相信不久的将来，高镇痛活性，低副作用甚至无副作用的新型镇痛剂一定会研发出来。

［1］ Bailey C P，Connor M.Opioids:cellular mechanisms of tolerance and physical dependence［J］.Curr Opin Pharmacol，2005，5(1):60－8.

［2］ Janecka A，Fichna J，Janecki T.Opioid receptors and their ligands［J］.Curr Top Med Chem，2004，4(1):1 －17.

［3］ Su Y F，McNutt R W，Chang K J.Delta-opioid ligands reverse alfentanil-induced respiratory depression but not antinociception［J］.J Pharmacol Exp Ther，1998，287(3):815 －23.

［4］ Chiba S，Hayashida M，Yoshikawa M，et al.Inhibitory effect of lowdose pentazocine on the development of antinociceptive tolerance to morphine［J］.J Anesth，2009，23(1):99 － 107.

［5］ Maggio R，Novi F，Scarselli M，Corsini G U.The impact of G-protein-coupled receptor hetero-oligomerization on function and pharmacology［J］.FEBS J，2005，272(12):2939 －46.

［6］ Li X Y，Sun L，He J，et al.The kappa-opioid receptor is upregulated in the spinal cord and locus ceruleus but downregulated in the dorsal root ganglia of morphine tolerant rats［J］.Brain Res，2010，1326:30－9.

［7］ Fujita-Hamabe W，Nagae R，Nawa A，et al.Involvement of kappa opioid receptors in the formalin-induced inhibition of analgesic tolerance to morphine via suppression of conventional protein kinase C activation［J］.J Pharm Pharmacol，2010，62(8):995 －1002.

［8］ Shu H，Hayashida M，Arita H，et al.Pentazocine-induced antinociception is mediated mainly by mu-opioid receptors and compromised by kappa-opioid receptors in mice［J］.J Pharmacol Exp T-her，2011，338(2):579 －87.

［9］ Liu N J，Chakrabarti S，Schnell S，et al.Spinal synthesis of estrogen and concomitant signaling by membrane estrogen receptors regulate spinal kappa-and mu-opioid receptor heterodimerization and female-specific spinal morphine antinociception［J］.J Neurosci，2011，31(33):11836 －45.

［10］ Gomes I，Gupta A，Filipovska J，et al.A role for heterodimerization of mu and delta opiate receptors in enhancing morphine analgesia［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(14):5135 －9.

［11］ Beaudry H，Dubois D，Gendron L.Activation of spinal mu-and delta-opioid receptors potently inhibits substance P release induced by peripheral noxious stimuli［J］.J Neurosci，2011，31(37):13068 －77.

［12］ Joseph E K，Levine J D.Mu and delta opioid receptors on nociceptors attenuate mechanical hyperalgesia in rat［J］.Neuroscience，2010，171(1):344 －50.

［13］ Ananthan S.Opioid ligands with mixed mu/delta opioid receptor interactions:an emerging approach to novel analgesics［J］.AAPS J，2006，8(1):E118 －25.

［14］ Billa S K，Xia Y，Moron J A.Disruption of morphine-conditioned place preference by a delta 2-opioid receptor antagonist:study of mu-opioid and delta-opioid receptor expression at the synapse［J］.Eur J Neurosci，2010，32(4):625 －31.

［15］ Gupta A，Mulder J，Gomes I，et al.Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration［J］.Sci Signal，2010，3(131):ra54.

［16］ Ljungqvist O，Nygren J，Thorell A.Modulation of post-operative insulin resistance by pre-operative carbohydrate loading［J］.Proc Nutr Soc，2002，61(3):329 －36.

［17］ Milan-Lobo L，Whistler J L.Heteromerization of the mu-and deltaopioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters mureceptor trafficking［J］.J Pharmacol Exp Ther，2011，337(3):868－75.

［18］ Golebiewska U，Johnston J M，Devi L，et al.Differential response to morphine of the oligomeric state of mu-opioid in the presence of delta-opioid receptors［J］.Biochemistry，2011，50(14):2829 －37.

［19］ He S Q，Zhang Z N，Guan J S，et al.Facilitation of mu-opioid receptor activity by preventing delta-opioid receptor-mediated codegradation［J］.Neuron，2011，69(1):120 －31.

［20］ Xie Z，Bhushan R G，Daniels D J，Portoghese P S.Interaction of bivalent ligand KDN21 with heterodimeric delta-kappa opioid receptors in human embryonic kidney 293 cells［J］.Mol Pharmacol，2005，68(4):1079 －86.

［21］ Waldhoer M，Fong J，Jones R M，et al.A heterodimer-selective agonist shows in vivo relevance of G protein-coupled receptor dimers［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(25):9050 －5.

［22］ Rowan M P，Ruparel N B，Patwardhan A M，et al.Peripheral delta opioid receptors require priming for functional competence in vivo［J］.Eur J Pharmacol，2009，602(2 －3):283 －7.

［23］ Berg K A，Rowan M P，Gupta A，et al.Allosteric interactions between delta and kappa opioid receptors in peripheral sensory neurons［J］.Mol Pharmacol，2012，81(2):264 －72.

［24］ Mogil J S，Grisel J E，Reinscheid R K，et al.Orphanin FQ is a functional anti-opioid peptide［J］.Neuroscience，1996，75(2):333－7.

［25］ Khroyan T V，Polgar W E，Jiang F，et al.Nociceptin/orphanin FQ receptor activation attenuates antinociception induced by mixed nociceptin/orphanin FQ/mu-opioid receptor agonists［J］.J Pharmacol Exp Ther，2009，331(3):946 －53.

［26］ Ueda H，Yamaguchi T，Tokuyama S，et al.Partial loss of tolerance liability to morphine analgesia in mice lacking the nociceptin receptor gene［J］.Neurosci Lett，1997，237(2 －3):136 －8.

［27］ Evans R M，You H，Hameed S，et al.Heterodimerization of ORL1 and opioid receptors and its consequences for N-type calcium channel regulation［J］.J Biol Chem，2010，285(2):1032 － 40.

［28］ Wen Q，Yan L D，Li Y L，Gong Z H.Primary investigation on heterodimerization of kappa-opioid receptor and ORL1 receptor［J］.Acta Pharm Sin，2011，46(9):1078 －83.

［29］ Marini P，Romanelli L，Valeri D，et al.Biphasic regulation of the acute mu-withdrawal and CCk-8 contracture responses by the ORL-1 system in guinea pig ileum［J］.Pharmacol Res，2012，65(1):100－10.

［30］沈 庆，刘慧芳，李 炜，等.μ/δ阿片受体相互调节作用及药物发现与设计策略［J］.中国药理学通报，2010，26(1):4 －8.

［30］ Shen Q，Liu H F，Li W，et al.Modulated interaction of μ/δ opioid receptors and the drug discovery and design strategy［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):4 －8.

［31］ Fujii H.Twin and triplet drugs in opioid research［J］.Top Curr Chem，2011，299:239 －75.

［32］ Pasquinucci L，Parenti C，Turnaturi R，et al.The benzomorphanbased LP1 ligand is a suitable MOR/DOR agonist for chronic pain treatment［J］.Life Sci，2012，90(1 －2):66 －70.

［33］ Chang K J，Rigdon G C，Howard J L，McNutt R W.A novel，potent and selective nonpeptidic delta opioid receptor agonist BW373U86［J］.J Pharmacol Exp Ther，1993，267(2):852 －7.

［34］ Gengo P J，Pettit H O，O’Neill S J，et al.DPI-3290［(+)-3-((alpha-R)-alpha-((2S，5R)-4-Allyl-2，5-dimethyl-1-piperazinyl)-3-hydroxyben zyl)-N-(3-fluorophenyl)-N-methylbenzamide］.II.A mixed opioid agonist with potent antinociceptive activity and limited effects on respiratory function［J］.J Pharmacol Exp Ther，2003，307(3):1227 －33.

［35］ Gengo P J，Chang K J.Mixed opioid receptor agonists as a new class of agents for the treatment of moderate to severe pain［M］//Chang K J，Porreca F，Woods J H.The Delta Receptor.New York:Marcel Dekker，Inc，2004:231 －44.