HPLC内标法同时测定芪麝丸中9种成分

杜思邈， 潘一峰， 张 宁*

(1.上海中医药大学，上海201203;2.上海现代中医药股份有限公司，上海200051)

芪麝丸由黄芪、川芎、青风藤、粉防己等多味药组成，具有益气化瘀、祛风通络、舒筋止痛的作用。黄芪［1］为方中君药，其黄酮类成分具有改善血液循环，提高免疫力的作用，其中毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷为其主要有效成分。川芎［2］同样为本方的君药，其中萜类成分 (如洋川芎内酯I、洋川芎内酯A)为其辛香行散，温通血脉作用的主要有效成分。粉防己［3］、青风藤［4］为方中佐药，其中生物碱类成分(如粉防己碱、防己诺林碱、青藤碱)为其祛风除湿，利水消肿止痛作用的主要有效成分。文献报道的有关上述9种成分的定量测定方法有薄层扫描法［5］、紫外分光光度法［6］、旋光法［7］、高效液相色谱法［8-11］、非水毛细管电泳法［12］等。

本实验建立了HPLC梯度洗脱内标法同时测定制剂中的毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花苷、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、粉防己碱、防己诺林碱、青藤碱9种成分，方法简便，精确度高，对于采用多成分监控复方制剂的质量具有参考价值。

1 仪器与试药

Agilent1200高效液相色谱仪。甲醇 (色谱纯，Spectrum公司);娃哈哈纯净水 (杭州娃哈哈集团，批号20110303);其余试剂均为分析纯。芪麝丸 (上海黄海制药有限公司，批号分别为100601、100602、101101);洋川芎内酯 I对照品 (自制，油状物，经1H-NMR、13C-NMR、IR、UV、MS鉴定为洋川芎内酯I，纯度为98%);毛蕊异黄酮对照品 (四川省维克奇生物科技有限公司，批号201104);毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品 (四川省维克奇生物科技有限公司，批号201101，纯度≥98%);芒柄花素对照品 (四川省维克奇生物科技有限公司，批号201005，纯度≥98%);芒柄花素苷对照品 (四川省维克奇生物科技有限公司，批号201006，纯度≥98%);洋川芎内酯A对照品(四川省维克奇生物科技有限公司，批号201103，纯度≥98%);粉防己碱对照品 (中国药品生物制品检定所，批号711-9304，含量测定用);防己诺林碱对照品 (中国药品生物制品检定所，批号0793-9203，含量测定用);青藤碱对照品 (中国药品生物制品检定所，批号0774-200206，含量测定用);异补骨脂素对照品 (中国药品生物制品检定所，批号110738-200511，含量测定用)。

2 色谱条件

Kromasil C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为乙腈-0.2%甲酸水溶液梯度洗脱;体积流量0.8 mL/min;测定波长262 nm;柱温30℃，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱顺序Tab.1 Gradient elution mode

在乙腈-0.2%甲酸水溶液梯度洗脱的色谱条件下，进行了内标物的筛选，尝试了龙胆苦苷、芍药苷、异补骨脂素等多种物质，其中异补骨脂素的保留时间较合适，且与其他9种物质在此条件下均可达到与基线分离，峰形对称，又因本制剂样品中不含异补骨脂素，故选定异补骨脂素为HPLC法的内标物。

3 实验方法与结果

3.1 供试品溶液的制备 本品研细，取1g，精密称定，置50 mL量瓶中，加适量甲醇超声50 min，放冷后加甲醇至刻度;另取10 mL量瓶，精密加入内标异补骨脂素溶液 (0.1 mg/mL)1 mL，再加入芪麝丸样品溶液至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过后进样。见图1。

图1 加内标的芪麝丸样品色谱图Fig.1 Chromatogram ofQishePillsamplewith internal standard

3.2 内标溶液的制备 精密称取于五氧化二磷干燥器中干燥至恒质量的异补骨脂素对照品10 mg置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1 mL含0.1 mg的内标溶液。

3.3 线性关系考察 精密称取各对照品一定量，置同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成混合对照品标准贮备液，并分别稀释配成不同质量浓度的混合对照品系列溶液，见表2。混合对照品液相色谱图见图2。

表2 各对照品溶液的质量浓度 /(μg·mL-1)Tab.2 Concentration of reference substances/(μg·mL-1)

图2 混合对照品色谱图Fig.2 Chromatogram of mixed reference substances

精密吸取上述对照品溶液各1 mL，分别置于10 mL量瓶中，精密加入内标异补骨脂素溶液(0.1 mg/mL)0.2 mL，加甲醇稀释至刻度，即得系列混合标准溶液，进行高效液相色谱仪测定，进样量10 μL。以对照品峰面积与异补骨脂素内标峰面积的比值 (Ag/As)为纵坐标 (Y)，相应对照品质量浓度 (C，μg/mL)为横坐标 (X)，绘制标准曲线，得相应对照品的回归方程。结果见表3。3.4 内标法校正因子的测定 精密吸取混合对照品贮备液1.0、4.0、8.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，精密加入异补骨脂素内标液 (0.1 mg/mL)0.2 mL，加甲醇定容，摇匀，滤过即得。高效液相色谱仪测定对照品及内标物质的峰面积，进样量10 μL，计算9种对照品校正因子。结果见表4。

表3 各对照品的线性关系Tab.3 Linear relationships of reference substances

3.5 空白试验 分别将原方中去除川芎、黄芪、防己、青风藤药材，按制剂工艺方法制备分别得到4种阴性制剂。分别取0.1 g阴性制剂，加甲醇25 mL超声溶解，按定量测定方法分析，4种阴性样品色谱在毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素苷、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、粉防己碱、防己诺林碱、青藤碱相应保留时间位置无干扰峰。见图3～6。

表4 各对照品对异补骨脂素的相对校正因子测定结果Tab.4 Relative calibration factor test results of different reference substances to isopsoralen

图3 缺黄芪的阴性制剂色谱图 (加内标物)Fig.3 Chromatogram of Qishe Pill sample without Astragali Radix(including internal standard)

图4 缺川芎的阴性制剂色谱图 (加内标物)Fig.4 Chromatogram of Qishe Pill sample without Chuanxiong Rhizome(including internal standard)

图5 缺防己的阴性制剂色谱图 (加内标物)Fig.5 Chromatogram of Qishe Pill sample without Stephaniae tetrandrae Radix(including internal standard)

图6 缺青风藤的阴性制剂色谱图 (加内标物)Fig.6 Chromatogram of Qishe Pill sample without Sinomenii Caulis(including internal standard)

3.6 稳定性试验 同一样品 (批号101101)供试液，测定0、2、4、6、8、10、12、24 h样品中有效成分，测定峰面积。结果表明，供试液中毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素苷、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、粉防己碱、防己诺林碱、青藤碱在24 h内稳定，其稳定性RSD分别为1.64%、1.31%、1.71%、1.23%、1.86%、1.91%、0.97%、0.90%、1.11%，均小于2%，表明样品在24 h内稳定性良好。

3.7 精密度试验 同一供试液 (批号101101)，按照上述方法测定，连续进样6次，测定峰面积。结果供试液中毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素苷、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、粉防己碱、防己诺林碱、青藤碱的RSD分别为0.63%、0.89%、0.91%、1.06%、0.77%、1.21%、1.43%、0.49%、1.33%，均小于 2%，表明精密度良好。

3.8 重复性试验 同一批号 (批号101101)制剂，研钵研碎，精密称取6份，每份约1.0 g，按3.1项下方法平行操作制备样品，进行测定，结果毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素苷、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、粉防己碱、防己诺林碱、青藤碱色谱峰面积RSD分别为1.37%、1.11%、0.89%、0.71%、1.41%、1.62%、0.39%、0.97%、0.81%，均小于2%，表明重复性良好。

3.9 定量限 当信噪比为10时，9种成分进样量见表5。

表5 9种成分定量限Tab.5 Quantitative limits of nine constituents

3.10 回收率试验 同一批号 (批号101101)制剂，研钵研碎，精密称取6份，每份约1.0 g，分别加入对照品溶液适量，按3.1项下方法制备样品，进行测定，计算回收率，结果制剂中毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花素、芒柄花素苷、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、粉防己碱、防己诺林碱、青藤碱的加样回收率分别为99.69%、98.26%、102.94%、98.64%、97.25%、100.21%、98.53%、99.87%、101.32%。

3.11 样品测定 取芪麝丸样品 (批号100601、100602、101101)按上述方法测定，并用内标法计算质量分数，测定结果见表6。

表6 芪麝丸中9种成分测定结果Tab.6 Measurement results of nine constituents in Qishe Pill

4 讨论

4.1 本实验测定的芪麝丸中的9种成分涉及3类成分，包括黄酮类、萜类及生物碱，其最大吸收波长青藤碱、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素为260 nm，防己诺林碱、粉防己碱、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A为280 nm，其各自的最大吸收虽不同，但均在260～280 nm范围内，经全波长扫描并兼顾9种成分最大吸收波长，确定检测波长为262 nm，以建立在单波长检测器的色谱条件。由于黄芪中黄芪甲苷是紫外末端吸收，最大吸收波长是203 nm左右，干扰较大，常采用ELSD检测器测定，因而本实验并未考虑采用紫外检测器对黄芪甲苷进行测定。

4.2 在本制剂色谱图中出现几个峰面积较大的未知物，有待进一步确定。

4.3 在固定仪器、固定色谱条件下，要先测定校正因子，再用内标法进行样品测定，并且每次更换色谱条件后，应对校正因子进行适时验证，以保证测定结果的准确可靠。

4.4 由于中药复方药味较多，其质量控制是一个较为复杂的过程，常采用对君药或用药量较多的药味的主要成分建立定量测定方法进行质量控制，此种传统质量控制方法较为片面。本实验采用内标法同时测定了芪麝丸中多种成分，且方法稳定、精密度高、专属性好，具有较强实用性，为其他品种的中成药质量控制方法的建立起到了一定的启示作用。

致谢:洋川芎内酯I对照品由上海中医药大学梁爽老师赠送。

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