UFLC法同时测定参芎葡萄糖注射液中6种主要成分

郑 林， 庞秀清， 兰燕宇， 李勇军， 王永林， 黄 勇*

(1.贵阳医学院药学院，贵州贵阳550004;2.贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳550004)

参芎葡萄糖注射液由丹参和盐酸川芎嗪配伍组成，具有抗血小板聚集，扩张冠状动脉作用，临床用于闭塞性脑血管病及其它缺血性血管疾病的治疗［1-3］。参芎葡萄糖注射液现行质量标准 (WS-10001-(HD-1136)-2002)的含量测定项目只对丹参素和盐酸川芎嗪进行定量控制［4］，难以全面反映制剂的化学成分特征。随着我国药品生产质量控制水平的提高和对注射剂安全、疗效、质量可控等问题重视程度的不断深入，国家食品药品监督管理局相继提出了“国家药品标准提高行动计划”和“中药注射剂安全性再评价工作”［5-7］，以全面提升药品质量控制水平。本研究基于参芎葡萄糖注射液UPLC-Q-TOF质谱定性分析和组成该注射液复方的药味丹参的化学成分［8-10］，最终确定了参芎葡萄糖注射液中6种主要化学成分，并建立了UFLC同时测定该6种成分的方法，为参芎葡萄糖注射液的质量控制与综合评价提供科学的参考依据。

1 仪器与试药

超快速液相色谱系统 (UFLC，岛津，包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Lcsolution工作站);AE2401/10万电子天平 (梅特勒－托利多仪器上海有限公司);超纯水机 (四川沃特尔科技发展有限公司)。

乙腈 (德国MERCK公司)为色谱纯;水为超纯水;其他试剂均为分析纯。丹参素钠 (批号110855200508)，盐酸川芎嗪 (批号 110817-200305)，原儿茶醛 (批号110810-200705)对照品购于中国药品生物制品检定所;迷迭香酸 (批号 MUST-10120901)，丹酚酸 B(批号 MUST-11031401)，丹酚酸A(批号MUST-10012901)对照品购于北京恒元启天化工技术研究院;参芎葡萄糖注射液 (贵州景峰注射剂有限公司提供)。

2 方法与结果［11-12］

2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相乙腈 (A)-0.05%磷酸(B)，体积流量1 mL/min，梯度洗脱，0～7 min，A 2% ～4%;7～12 min，A 4% ～18%;12～15 min，A 18% ～20%;15～22 min，A 20% ～23%;22～32 min，A 23% ～32%;32～42 min，A 32%～35%;42～50 min，A 35% ～90%。柱温40℃，检测波长220 nm，进样量10 μL。

2.2 混合对照品溶液制备 分别精密称取丹参素钠、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A适量，分别置于6个10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为1.056、7.649、1.084、1.020、1.046、1.036 mg/mL的对照品贮备液。分别精密量取上述6种对照品贮备液8、6、2、1.2、1.2、1.2 mL置同一个20 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备 精密量取本品10 mL，加5%葡萄糖溶液稀释，定容至25 mL，摇匀即可。

2.4 专属性试验 分别吸取对照品混合溶液和供试品溶液10 μL，在上述色谱条件下测定，结果6种被测成分分离良好，在供试品溶液色谱中与其他物质色谱峰分离度均大于1.5(见图1)。同时供试品中被测定化合物色谱图与对照品色谱图比较，供试品中被测定的6个化合物的紫外光谱图与各自对照品的紫外光谱图一致，且经不同流动相系统考察，6个被测成分的保留时间分别与对照品的保留时间一致，说明该方法具有良好的专属性。

2.5 线性关系考察 精密吸取混合对照品贮备液0.25、0.5、1、2、4、8 mL分别置于6个 10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，按拟定的色谱条件注入UFLC测定，以峰面积对进样质量进行线性回归，得各被测成分的回归方程、相关系数及线性范围，见表1。

图1 对照品 (A)和样品 (B)的UFLC色谱图Fig.1 Chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

2.6 精密度试验 取同一供试品溶液，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别进样测定6次，结果6个被测定成分峰面积平均值的RSD分别为0.45%、0.69%、1.87%、0.61%、1.12%、1.17%，表明仪器的精密度良好。

表1 6个被测成分的线性关系Tab.1 Linear relationships of six components

2.7 重复性试验 取同一批号样品6份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液并进行测定，结果6个被测定成分质量浓度的RSD值分别为0.46%、0.40%、1.40%、0.81%、1.71%、2.34%。

2.8 中间精密度试验 以不同时间，不同实验人员取与重复性试验同一批号的供试品6份，对其进行测定，将测定结果与重复性结果进行比较，显示精密度良好，RSD值分别为 0.55%、1.26%、2.19%、0.22%、0.36%、0.68%。

2.9 供试品溶液稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、12 h进样测定，结果6个被测定成分峰面积平均值的RSD分别为0.97%、0.93%、2.60%、0.81%、1.16%、2.17%表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.10 回收率试验 精密量取同一批号的参芎葡萄糖注射液5 mL共6份，分别置25 mL量瓶中，精密加入混合对照品溶液适量，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进行测定。计算回收率及RSD，结果见表2。

2.11 样品测定与结果分析 取不同批次的参芎葡萄糖注射液，每个样品平行做2份，按2.3项下方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件进行6种成分的分析，用当天随行的对照品溶液进行计算，测得6种成分的质量浓度结果见表3。

3 讨论

3.1 用二极管阵列检测器分别对6种成分进行全波长扫描得知，丹参素、盐酸川芎嗪、原儿茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A的最大吸收波长分别为220，217，230，220，221，221 nm，为兼顾各组分的检测信号强度和检测灵敏度，选择220 nm作为检测波长。

表2 回收率测定结果 (n=6)Tab.2 Determination results of recovery tests(n=6)

表3 样品测定结果 (n=2)Tab.3 Determination results of samples(n=2)

3.2 曾对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.5%乙酸等不同配比流动相系统进行考察，经等度或梯度试验比较，结果表明，以乙腈-0.05%磷酸为流动相梯度洗脱分离效果较好，所检测的6个成分色谱峰既能达到基线分离，又缩短了分析时间。

3.3 本实验首次研究建立了UFLC法同时测定参芎葡萄糖注射液中6种活性成分的方法，方法简便，结果可靠，通过多指标成分的定量控制，能够综合反映制剂的内在质量，可用于参芎葡萄糖注射液的质量控制。

［1］陈兴坚，刘建红．参芎葡萄糖注射液的临床应用进展［J］．中国实用医药，2010，5(13):247-249．

［2］于红梅．参芎葡萄糖注射液治疗脑梗死临床观察［J］．中国现代药物应用，2009，3(8):132-133.

［3］吴晓君，周德甫．参芎葡萄糖注射液抗冠心病心绞痛的临床疗效观察［J］．现代医药卫生，2010，26(9):1344-1345．

［4］卫生部药品标准．化学药品地方标准上升国家标准第十二册［S］．2002．

［5］周福成．关于规范提高中药标准工作进展与任务要求［J］．中国药品标准，2005，6(6):3-6．

［6］杨 明，伍振峰，王 芳，等．中成药再评价方法与策略研究［J］．中国新药杂志，2010，19(24):2267-2270．

［7］高 宁，罗志琴，谢广茹，等．参麦注射液上市后安全性再评价研究［J］．医药导报，2010，30(7):961-962．

［8］郭增军，龙丽辉，徐 颖，等．UPLC-ESI-MS分析丹参药材、脂溶性及水溶性提取物的色谱、质谱行为及相关性［J］．中药材，2010，33(6):925-928．

［9］赵新锋，王中秋，赵 欣，等．丹参的HPLC-ESI-MSn分析［J］．中成药，2005，27(9):1068-1069．

［10］刘 娟，刘 颖．丹参药理活性成分研究进展［J］．辽宁中医药大学学报，2010，12(7):15-17．

［11］王 伟，张 雪，褚文静，等．高效液相二极管阵列检测法同时测定丹参粉针剂中4种水溶性成分的含量［J］．中成药，2011，32(2):266-268．

［12］张慧娴，杜守颖，陆 洋，等．HPLC同时测定丹参水溶性及脂溶性5种成分的含量［J］．中国实验方剂学杂志，2010，16(15):34-36．