软肝升白颗粒对硫代乙酰胺诱发大鼠肝硬化模型的影响

郭争荣，刘金霞，程 志，候艳宁，李兵顺，李敏然，孙殿兴*

(1石家庄白求恩和平医院，石家庄050082;2石家庄市人民医院;3承德医学院)

目前临床上还缺乏确切有效的逆转肝硬化药物，研究者逐步发现许多传统中草药具有比较好的抗肝纤维化疗效，以小柴胡汤、复方861合剂、复方鳖甲软肝片、冬虫夏草、甘草、丹参、苦参等一大批具有活血化瘀、软坚散节功效的单方、复方中药制剂为代表。中药组方防治肝纤维化有比较光明的发展前景，它们以其多环节、多层次及多靶点的综合作用，具有广阔的开发和应用前景。2010年1月～2011年12月，为深入研究软肝升白颗粒的疗效和作用机制，通过建立硫代乙酰胺(TAA)诱导的大鼠肝硬化模型，采取不同时间和不同剂量分别观察软肝升白颗粒对肝纤维化大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、层黏连蛋白(LN)、透明质酸(HA)含量的影响及肝组织改变，为临床寻找肝硬化治疗方案开辟新的治疗途径和方法［1］。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级Wistar大鼠100只，雄性，(180 ±20)g，由河北医科大学动物实验中心提供;TAA购买于Sigma公司、软肝升白颗粒由白求恩国际和平医院制剂科配制、复方鳖甲软肝片由解放军302医院研制，内蒙古集宁制药厂馈赠，生产批号20060609;HA、LN检测试剂盒购自上海海军医学研究所。

1.2 肝纤维化模型的建立 肝硬化模型的制作应用TAA诱导法，TAA用精确度为1/万的电子天平称取并用饮用水稀释。用0.03%TAA诱导饲喂［1］，每1～2 d更换1次饮用水，确保药物浓度的稳定，诱导时间20周。

1.3 分组和给药 80只大鼠造模成功后，随机分为4组，每组20只，高剂量治疗组(A组)大鼠给予软肝升白颗粒8 g/(kg·d)灌胃，低剂量治疗组(B组)大鼠给予软肝升白颗粒4 g/(kg·d)灌胃，阳性药物对照组(C组)大鼠给予鳖甲软肝片0.8 g/(kg ·d)灌胃，模型对照组(D组);另设20只大鼠为正常对照组(E组)。D组和E组分别给予等体积的生理盐水灌胃。于造模结束后，停用TAA 1周，开始给予上述药物治疗，1次/d，灌胃给药［2］。

1.4 标本留取和指标检测 分别在治疗后第4周和8周处死大鼠，腹主动脉取血，分离血清，检测肝功能及肝纤维化指标，取部分肝组织，0.5 cm×0.5 cm×1 cm，10%甲醛固定，进行HE染色和天狼猩红特染。HE染色光学显微镜下观察，并进行Knodell评分［3］。天狼猩红染色用偏振光显微镜下观察Ⅰ型胶原情况，每个标本供观察10个视野，并采用Photoshop软件的Histogram功能分析统计各组织内Ⅰ型胶原所占面积的百分数，经图像分析。剩余肝组织－80℃冻存，备用。检测肝组织内羟脯氨酸的含量，采用胃酶酸解法［4］，根据测得的A560和标准曲线计算出每克肝组织的羟脯氨酸的含量。

1.5 统计学方法 应用SAS8.0统计分析软件，组间比较采用单因素方差分析，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝纤维化大鼠肝脏组织形态学变化

2.1.1 HE染色 光镜下正常组大鼠肝组织有完整的肝小叶结构，肝细胞多为单核，肝板呈条索状，围绕中央静脉呈放射状排列，无变性、坏死、炎症细胞浸润和纤维组织增生。D组大鼠停用TAA后4周时，肝组织可见大量肝细胞脂肪变性，呈空泡状，胞质着色亦深，偏嗜碱性。另有水样变性甚至气球样变，部分细胞出现异型性，肝细胞核增大，着色深或双核。近90%标本可见散在的不同程度的坏死细胞，正常肝小叶结构遭到破坏;可见明显的纤维组织增生，纤维间隔占整个视野2/3以上，增宽至2.5 mm以上，由汇管区、小叶间进一步深入并分割肝小叶、假小叶形成。汇管区、肝窦及中央静脉周围可见多形核白细胞、淋巴细胞、单核细胞及嗜酸性细胞等炎性细胞浸润;停用TAA后8周时，肝细胞脂肪变性和肝组织纤维化程度有所恢复，但与其他各组不同时间的肝组织学变化仍有显著性差异。A组可见肝纤维化明显减轻，纤维间隔变细，肝细胞大小、形态接近正常，仅有少量空泡和气球样变，仅见少量炎症细胞浸润。B组和C组病理改变相似，肝组织内可见不同程度的炎症细胞浸润，变性坏死以脂肪变为主，形成空泡，但纤维间隔变窄。总之，纤维组织增生、肝细胞变性及炎症反应较D组明显减轻，但较A组抗纤维化效果差，见插页Ⅱ图9。各组Knodell评分结果见表1。

表1 大鼠在治疗4周和8周时肝组织Knodell评分(±s)

表1 大鼠在治疗4周和8周时肝组织Knodell评分(±s)

注:与D组比较，*P＜0.05;与C组比较，#P＜0.05;与B组比较，△P＜0.05

组别 4周 8周A组 11.0±1.2*#△ 7.3±1.4*#△315.46 220.65 B组 13.3±2.0* 9.5±1.0*# C组 14.9±1.4* 11.9±1.7* D组 24.8±2.3 19.1±2.3 E组 0* 0* F值

2.1.2 天狼猩红染色 A组和B组与D组比较，肝小叶结构破坏减轻，肝脏胶原纤维增生亦明显减轻，纤维条索变细变窄，肝小叶结构恢复，汇管区和中央静脉周围胶原显著减少，见插页Ⅲ图10，各组Ⅰ型胶原面积百分比见表2。

表2 大鼠在治疗4周和8周时Ⅰ型胶原面积百分比(%，±s)

表2 大鼠在治疗4周和8周时Ⅰ型胶原面积百分比(%，±s)

注:与D组比较，*P＜0.05;与C组比较，#P＜0.05;与B组比较，△P＜0.05

组别 4周 8周A组 17.2±1.4*#△ 12.7±1.4*#△181.48 282.30 B组 21.0±2.1* 16.2±1.2* C组 21.3±2.4* 17.8±1.0* D组 29.9±4.0 27.3±2.8 E组 2.2±0.7* 1.9±0.3* F值

2.2 中药对大鼠肝功能的影响 见表3。

表3 大鼠在治疗4周和8周时血清ALT含量(U/L，±s)

表3 大鼠在治疗4周和8周时血清ALT含量(U/L，±s)

注:与D组比较，*P＜0.05;与C组比较，#P＜0.05;与B组比较，△P＜0.05

组别 4周 8周A组 103.5±10.8*#△ 84.2±8.4*#△234.01 533.82 B组 137.5±11.1* 96.5±9.0* C组 141.0±10.9* 94.2±7.7* D组 224.7±16.0 191.6±9.5 E组 25.7±5.8* 25.6±5.7* F值

2.3 血清HA、LN的变化 见表4。

表4 各组不同时间血清HA、LN值(ng/mL，±s)

表4 各组不同时间血清HA、LN值(ng/mL，±s)

注:与D组比较，*P＜0.05;与C组比较，#P＜0.05;与B组比较，△P＜0.05

组别HA 4周 8周LN 4周 8周A组 737.1±35.4*#△ 482.3±47.7*#△ 518.9±29.6*#△229.3±32.5*#△B组 1 047.0±84.8* 721.4±33.9* 776.2±38.0* 306.4±22.3* C组 1 001.9±78.2* 729.2±73.0* 822.5±39.7* 502.3±25.1* D组 1 328.9±80.4 1 028.4±69.9 1 014.8±79.5 797.8±57.4 E组 117.1±9.7* 116.2±12.8* 108.7±9.5* 109.8±8.8* F值498.07 418.29 593.45 652.99

2.4 中药对肝组织中羟脯氨酸羟的影响 见表5。

表5 各组不同时间肝组织内羟脯氨酸含量(μg/g肝组织，±s)

表5 各组不同时间肝组织内羟脯氨酸含量(μg/g肝组织，±s)

注:与D组比较，*P＜0.05;与C组比较，#P＜0.05;与B组比较，△P＜0.05

组别 4周 8周A组 69.1±6.2*#△ 34.4±3.3*#△425.45 459.13 B组 95.4±7.1* 57.7±6.9* C组 100.3±7.8* 61.6±3.9* D组 143.6±10.7 112.5±8.2 E组 14.1±1.9* 14.1±2.7* F值

3 讨论

肝硬化属于中医学“瘤”、“痹”、“痞”、“积”等范畴，痰瘀互结，致使全身气、血、津液运行不畅，阴阳失调，最终形成肝硬化。软肝升白颗粒由黄芪、丹参、当归、桃仁、白术、党参、栀子、茵陈等16味中药组成，具有活血软坚、化痰除湿功效。丹参，常用的活血化瘀中药，在临床以及实验研究中都被证实有较明确的抗肝硬化作用，抗肝硬化机制可能与其下调细胞因子、阻断肝脏库普弗细胞和肝星状细胞(HSC)活化、减少胶原组织的合成及促进自由基清除和抗脂质过氧化作用有关［5］。黄芪具有补中益气、升阳固表等功效，可以明显减少总胶原及Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原在大鼠肝脏的病理性沉积，降低胶原蛋白含量，对实验性肝纤维化大鼠具有明显的治疗作用［3，6］。体外实验表明，黄芪可明显抑制体外激活的HSC增殖及胶原的产生［7］。临床应用黄芪注射液可以改善肝纤维化患者的肝功能，降低血清ALT、AST，提高ALB水平，使血清HA、LN下降;并能降低慢性肝炎患者血清TGF-β1、HA的水平，明显改善肝纤维化程度［8］。桃仁散瘀结积聚，当归活血补血，对实验性肝损害和中毒性肝炎，有保护肝细胞和恢复肝功能的作用，并可防止肝糖原降低，对体外培养肝细胞DNA、RNA的合成有促进作用［9］。桃仁还有抗炎、抗过敏、利胆及抗肝纤维化的作用。茵陈对实验性肝损伤有保护作用，可减轻肝细胞肿胀、变性和坏死程度，改善临床症状［10］。

本研究通过联合上述药物，从活血化瘀、抗炎和抗纤维化等方面配制软肝升白颗粒，用于治疗肝纤维化模型，与鳖甲软肝片比较，从肝组织学和肝功能及纤维化指标等多方面证实，具有很好的疗效。

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