环磷酰胺对长爪沙鼠精子畸形的影响

杨 僖，陈耿喆，何秉嘉，梁 坤，梁成结，魏 莲

（1.广州医学院第二临床学院，广州 510182；2.广州医学院实验动物研究中心，广州 510182； 3.广州医学院公卫学院，广州 510182）

长爪沙鼠又称蒙古沙鼠，主要分布在我国的内蒙、河北、陕西、宁夏等草原地带［1］。具有独特的生物学特性，是国内外正在开发与利用的多能性实验动物，越来越广泛地应用于生命科学的研究。由于对长爪沙鼠的繁殖和使用起步较晚，目前供应长爪沙鼠的单位仅有少数几家。有必要从不同方面对长爪沙鼠进行研究，为该物种的实验动物化，资源开发提供了理论依据。

环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）是人工合成氮芥类烷化剂，是一种毒性较低，是细胞周期非特异性广谱抗肿瘤药，也是导致生殖细胞遗传性损伤的毒作用，对人白细胞及血小板也有一定的破坏作用［2］。本实验用 CP作诱变剂，探讨其对长爪沙鼠精子的影响，未见报道。现我们在实验室进行了该项试验观察，以期探讨出长爪沙鼠在临床用药或毒理研究更多更好相关数据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：雄性长爪沙鼠，体重在52～70 g，由广州医学院动物实验中心提供［SCXK（粤） 0007612］。

1.1.2 材料：环磷酰胺（CP）为江苏恒瑞股份有限公司产品，批号为 09090321；伊红染液及染缸；甲醇；生理盐水；注射器；抗凝管；消毒用品，2％戊巴比妥钠（40 mg/kg）；离心管；手术剪刀；镊子等。

1.1.3 仪器：离心机；照相机为 Canon PC1252；显微镜Olympus BHA；电子天平等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组：选用体重在65±5 g的雄性长爪沙鼠28只，随机分为4组，每组7只，设正常对照组和CP组（分低、中、高剂量组其剂量分别为20 mg/ kg、30 mg/kg、40 mg/kg）［3］。试验前动物观察一周，记录食量、体重、外观体征和行为活动。饲养环境为广州医学院动物中心，室内温度21～24℃，室内湿度45％～70％，动物自由进食及饮水，饲料由广东省医学实验中心提供。

1.2.2 动物处理：CP用生理盐水溶解，给药前配制，CP组每日按低、中、高三个剂量腹腔注射给药。正常对照组用等量生理盐水注射。连续注射5 d。给药后，常规饲养。

1.2.3 动物取材：给药30 d后，每组取5只长爪沙鼠麻醉处理：分别取出两侧附睾，置于盛有0.8 m L 0.9％的生理盐水细胞培养液中，用眼科剪剪碎附睾组织或镊子轻轻撕开附睾包膜，徐徐摇动附睾组织，静置5～10 m in，用镊子将组织碎片取出，装入离心管，3000转速/m in的离心机离心 5 m in，去除上清液，留下约0.2 m L液及沉淀物，混匀余液并用加样器吸取40μL精子悬液，滴在玻片上推片，自然晾干，每只长爪沙鼠附睾液制片5张，甲醇固定10 m in后再自然晾干，2％的伊红染色30 m in，蒸馏水冲洗干净，晾干，显微镜下进行阅片观察。

1.2.4 观察指标精子畸形率：在显微镜下计数，每张片计数200条完整精子中出现的畸形的精子数，每组共计1000条。从而计算出各试验组精子畸形率（％）。同时观察畸形的类型。

1.2.5 统计学处理：统计学分析采用spss12.0软件进行处理，所得数据均用均数 ±标准差（±s）表示，统计方法使用单因素方差分析（onewayANOVA），以a=0.05作为检验标准。

2 结果

2.1 精子畸形率

低、中、高剂量组分别与正常组比较，长爪沙鼠精子畸形率差异极显著（P＜0.01）；低、中剂量组分别与高剂量组相比较，长爪沙鼠精子畸形率差异极显著（P＜0.01）；低剂量组与中剂量组比较，精子畸形率差异不显著（P＞0.05）。

从表2数据可知，长爪沙鼠精子受环磷酰胺影响而产生的畸形类型主要为尾折叠、尾粗细/长短/扭曲。

表1 CP对长爪沙鼠精子畸形的影响Tab.1 The influence of CP to the abnormalities of Mongolian gerbils＇sperms

表2 环磷酰胺对长爪沙鼠精子畸形类型统计Tab.2 Statistics of different influential types of CP on Mongolian gerbils＇sperms

2.2 精子显微镜下观察

显微镜下观察大量精子尾部畸形，以尾折叠、尾粗细/长短/扭曲为主，尾折叠占比例最多（见彩插1图1～4）。

3 讨论

精子的成熟和正常形态发育受多基因控制，人和哺乳动物的基因在正常情况下精液中也有部分精子畸形，但在某些生殖毒物的作用下，精子畸形数量会大大增加。

在试验各组中，低、中、高剂量组长爪沙鼠精子畸形率分别和正常组比较，差异均极显著（P＜0.01），说明环磷酰胺对长爪沙鼠的精子有明显的致畸影响；低、中剂量分别与高剂量组相比较，长爪沙鼠精子畸形率差异极显著（P＜0.01），说明环磷酰胺用药不同剂量对长爪沙鼠精子致畸率有明显差异；低剂量组长爪沙鼠精子畸形率与中剂量组比较，差异不显著（P＞0.05）。

上述提示，环磷酰胺对长爪沙鼠精子有一定的致畸率。在一定剂量内，环磷酰胺对长爪沙鼠的精子致畸率无明显区别。当环磷酰胺高于某个剂量，随环磷酰胺用药剂量越高，对长爪沙鼠的精子畸形率越高。具体的CP剂量范围对沙鼠精子具体致畸率需要进一步实验验证。

尾折叠畸形类型是环磷酰胺对长爪沙鼠精子的畸形最多的类型，最高占畸形数的42.30％；尾粗细/长短/扭曲类型：是随着环磷酰胺剂量的增加，其在畸形数中所占的比例有所增加，在高剂量组中达到36.96％，高剂量组有个别模型组的精子尾扭曲率占其全精子的95％以上；无钩也是畸形数较多的类型，但其受环磷酰胺剂量影响较小；而其他类型如复合畸形、钩变短/直、小头、胖头等畸形数目也较多，双头这一类型在畸形数中所占比例最少。综合来看，环磷酰胺对长爪沙鼠精子尾部影响最大。

本实验与李凤文“环磷酰胺对小白鼠精子畸形影响的探讨”实验所用的药品及剂量相同，取材方法相同.分组方法相同，但实验用的动物品种不同，给药的方式不同：本实验用长爪沙鼠，通过腹腔注射给药；李凤文实验是用小白鼠通过灌胃给药，所得结果也有差异，异同对比如下：

1.两实验正常组的精子畸形率相差明显。李凤文小白鼠实验显示：正常组畸形率是1.34％，而本实验正常组畸形率是28.7％，说明不同品种的动物其正常组精子畸形率是有所不同。长爪沙鼠精子畸形率明显比小白鼠精子畸形率高。这可能与长爪沙鼠的品种遗传有关，也可能与我们在实验操作中引起有关。但本人认为：长爪沙鼠精子畸形率高，是其品种与遗传占主要的。长爪沙鼠精子畸形率高现象与其出生率较低相吻合，也可说明这一点；反之，大小鼠精子畸形率明显低，而其出生率每胎平均十多只，是长爪沙鼠出生率的几倍。当然不同品种的鼠出生率与其排卵数量等因素也有一定的相关性，这些都有待进一步研究。

2.两实验显示：CP都能对这两种动物的精子起到明显的致畸作用，但两实验提示CP对各自精子主要畸形类型不同：小白鼠的精子畸形是不定形畸形为主占8.52％，长爪沙鼠精子主要畸形是尾折叠畸形类型，最高占畸形数的42.30％。

3.由于两实验的给药方式不同，可能吸收的药量有所不同；实验的动物不同，对环磷酰胺的敏感程度也有所不同，这些有待进一步探讨。

本实验研究显示，高剂量组动物模型出现死亡现象。这可能“高剂量”已达到CP对长爪沙鼠致死量附近，这有待进一步研究。

［1］周立志，马勇，李迪强.大沙鼠在中国的地理分布［J］.动物学报 ，2000，46（2）：130-137.

［2］吴基良，罗健东.药理学北京：科学出版社［M］.2007：291 -296.

［3］李凤文，刘荣珍，赵鹏，等.环磷酰胺对小白鼠精子畸形影响的探讨［J］.广西医学，2003，25（3）：328-330.

［4］冯波，申吉泓，袁彬彬.小鼠腹腔注射环磷酰胺建立少精子症模型的稳定性探讨［J］.中华男科学杂志，2007，13（1）：71-73.

［5］Boekelheide K.Mechanisms of toxic damage to spermatogenesis［J］.JNatl Cancer Inst Monogr，2005，（34）：6-8.

［6］贾庆军，刘天鹏，冯长龙，等.环磷酞胺对小鼠生殖细胞和精子的影响［C］.见（In）：贾庆军，刘天鹏，冯长龙，等.第五届中国肿瘤学术大会论文集.

［7］张桥.卫生毒理学基础［M］.北京人民卫生出版社：2001，249-252.

［8］祝寿芬，仇玉兰，王仲霞.三氧化二砷对小鼠精子形态的影响［J］.卫生毒理学杂志，1997，11（2）：129-130.