短端粒小鼠与正常小鼠间充质干细胞的分离培养比较

宋 舸，张俊伶，鞠振宇

（1.中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021；2.中国医学科学院放射医学研究所天津市分子核医学重点实验室，天津 300192）

实验小鼠作为研究间充质干细胞（MSC）功能的载体发挥着重要作用，传统获取小鼠MSC方法主要来自骨髓，利用MSC细胞具有在塑料培养皿上贴壁的特点得到。但是因为小鼠骨髓的MSC数量很少，并且有造血细胞的污染，常给研究带来不少不确定因素。此后不断对此方法进行改进，如通过磁珠分选、逆转录病毒转染等，然而仍旧存在不易标准化，并且有或多或少损伤细胞生物学特性的问题。因此，受到有关人体骨片中获得MSC的方法的启发［1］，我们尝试通过培养小鼠的下肢皮质微粒骨，同时也由于皮质骨中造血细胞污染机会很少，希望建立获得小鼠MSC简便稳定的方法。

端粒是真核细胞染色体末端的一种保护性结构，在维持染色体末端稳定性等方面起重要作用。端粒被认为是细胞衰老的生物钟。研究证明端粒的长度随着人体的衰老呈进行性缩短，端粒的长度与许多衰老相关的疾病密切相关。骨质疏松作为一种与衰老相关的疾病，也与染色体末端端粒功能的异常相关［2］。研究衰老模型的 Terc-/-鼠，经过连续传代到第三代（G3），其端粒长度与人接近，而且它的骨骼畸形、骨质疏松的表型也更加容易观察，因此本实验以WT鼠和Terc-/-鼠G3为研究对象，通过体外细胞培养建立获取MSC的方法，初步比较它们的生物学特征，为今后深入研究其各项功能提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 实验动物

WT鼠和Terc-/-鼠的饲养和使用符合中国医学科学院实验动物研究所标准。研究使用的小鼠均为G3代，WT为对照。分别取2月龄和9月龄鼠各5只，所用的动物遗传背景为 C57BL/6。WT鼠购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心［SCXK（军）2007-004］。

1.2 小鼠皮质骨MSC的分离

小鼠脱颈处死后，浸泡在70％酒精中2 m in，转入100 mm无菌平皿，切开下肢皮肤，显微剪刀尽可能分离干净附着在股骨和胫骨上的肌肉、韧带，将骨组织放入无菌纱网布上，搓去残留的肌肉和韧带。将骨组织置入35 mm无菌平皿中，加入5 m l培养液（α-MEM+1％P/S+2％FBS），为保持MSC细胞活性，操作不易超过2 h。剪去骨两端的骨骺以便冲洗髓腔内的造血细胞，冲洗至髓腔变白。将骨组织剪成1～3 mm2大小颗粒，转至25 cm2平皿中，加入3 mLα-MEM（含1 mg/mL胶原酶Ⅱ），在37℃振摇1～2 h。回收消化松散的骨片准备原代培养。

1.3 小鼠皮质骨MSC的原代培养

将经上述分离所得的骨片种于25 cm2平皿中，加入6 m Lα-MEM（含10％FBS及1％P/S），在37℃，5％CO2条件下连续培养3 d，此间避免不必要的晃动干扰。3 d后更换培养液，弃未黏附的细胞，加入6 m Lα-MEM（含10％FBS及1％P/S）继续培养2 d。培养5 d后，弃培养液，加入3 m L 0.25％胰酶+0.02％EDTA（室温）消化3 m in，回收细胞。骨片仍用于继续获得MSC细胞，方法同前。MSC细胞按每孔细胞1×104个CM2的密度接种于6孔培养板内，加入α-MEM（含10％FBS及1％P/S）培养液，于37℃，5％CO2条件下培养；接种3 d后进行第1次换液，以后隔日换液。每天随机抽取3只实验动物的MSC作细胞生长动力学观察，直至贴壁细胞铺满整个培养孔的底部。

1.4 小鼠皮质骨MSC的传代培养及 MSC的增殖分析

原代培养一旦铺满整个培养孔的表面，即可用0.25％胰酶+0.02％EDTA液消化分离（18～25℃，3 min）贴壁细胞，传代接种培养的比例1∶3，标记为P1，隔日换液，至贴壁细胞铺满培养孔的底面。再重复以上操作，进行下一代传代接种培养，标记为P2，余类推。抽取3只实验动物MSC由P1代开始，逐代进行传代培养，直至培养细胞出现衰老征象，停止传代培养。以细胞群体倍增值（population doublings，PDs）［3］作为分析动物 MSC的自我更新能力的指标，PDs=lg（培养后细胞计数/培养前细胞计数）/lg2。各代PDs值累加即得最终的累积细胞群体 倍 增 值 （cumulative population doublings，CPDs）。

1.5 数据统计分析

采用SPSS16.0软件，将2月龄和9月龄WT鼠和Terc-/-鼠MSC的传代生长克隆数取均数，进行计量资料的T检验比较。

2 结果

2.1 MSC原代培养的生长特征

WT鼠MSC原代培养生长显示，原代接种后的48 h开始从骨片迁出并贴壁，其后24 h可见大量细胞游出在骨片边缘，贴壁生长细胞外形为纺锤型或梭形，3 d为MSC生长的潜伏期，此期主要为MSC的贴壁生长阶段，培养细胞的有丝分裂活动不甚活跃；第4～6天开始，相差显微镜下可以观察到贴壁细胞已形成大小不一的多个细胞克隆，说明此时细胞的有丝分裂活动开始变得活跃起来（图1）；第7～8天这些细胞克隆进一步扩大，许多细胞克隆彼此相连，细胞生长曲线显示此阶段细胞数目呈指数级递增，此期为MSC原代培养生长的对数增殖期；第9～11天，细胞克隆彼此相连并铺满整个培养孔底面的大部分，细胞生长曲线显示MSC生长进入一个平台期；随后贴壁生长的MSC开始铺满整个培养孔底面，原代培养结束。通过比较2月龄和9月龄WT鼠和Terc-/-鼠 MSC的原代生长特征，Terc-/-鼠的MSC生长缓慢，形成克隆数量少，原代细胞形成克隆数为WT鼠＞Terc-/-鼠。

图1 接种4 d后MSC形态镜下观察Fig.1 Morphology of MHCs observed by microscope

2.2 MSC传代培养的生长特征

WT鼠MSC传代培养多数于P9代以后开始出现衰老征象。传代细胞的生长较原代要快些，多于接种后10 d即可铺满整个培养孔的底面。对2月龄和9月龄WT鼠和Terc-/-鼠传代细胞培养观察比较，以镜下大于10个细胞的计为一个集落（图2，P＜0.01）。传代培养潜伏期约为24～36 h；传代培养对数增殖期约为4～6 d；对数增殖期结束后至接种后第10天，MSC生长逐渐缓慢，进入平台期。

2.3 MSC自我更新能力分析

随着传代培养代数的渐次增加，MSC的生长速度有逐渐缓慢的趋势。传代接种第5天后，Terc-/-鼠P4以后的MSC生长速度减缓明显，至接种后第10天计算所得的MSC数目WT鼠＞Terc-/-鼠。三种不同基因型鼠各随机抽取的3个样本，传代培养观察发现出现衰老征象的情况分别是：WT鼠于P10，Terc-/-鼠于 P7，故统计 MSC的 PDs及 CPDs计算至P7。由图3可见，从P1至P8每代MSC的

图2 小鼠MSC的P2传代细胞培养生长情况Fig.2 Culture status on passage 2 cells of MSC from mice

PDs值在P3达到高峰，而P7之后则仅为不足1，说明增殖能力减弱；WT鼠的CPDs值为10.4±1.1，明显高于Terc-/-鼠，在P1至P7阶段的体外培养分离中，MSC的有丝分裂活动旺盛，具有活跃的增殖倍增能力。

图3 两种小鼠MSC传代培养的CPDL变化比较Fig.3 Cumulative population doublings＇difference between two type mice

3 讨论

间充质干细胞多来自骨髓，也存在于其它器官和组织［4］，一定条件下MSC可以分化成多种组织，包括骨，脂肪和软骨。MSC的功能除了促进造血和组织修复外，更多的应用在疾病治疗方面，如骨骼缺损，糖尿病，急性移植排斥反应和类风湿关节炎等。为实现上述临床应用研究，以小鼠为研究对象进行了大量的实验研究，如何从小鼠提取足够多的MSC成为关键。

小鼠 MSC分离培养方法起初由 Friedenstein等［5］建立，利用MSC具有能粘贴在塑料培养瓶的特性分离MSC，利用该方法从人类和大动物骨髓中分离获得MSC比较成功，但在小鼠骨髓内获得足够多的MSC相对困难，因为小鼠的骨髓腔内MSC数量低，同时也存在造血细胞的污染。为了改进这这一方法，有研究尝试使用磁珠分选、逆转录转染和建立独特培养体系等方法［6，7］，但是这些方法标准化困难，并且或多或少损伤细胞生物活性。

细胞生物学原理显示细胞的数量及密度对其增生和分化会产生很大的影响，由于小鼠MSC在骨髓中所占的细胞比例少，因此设法改进在体外条件下提取纯化更多MSC成为实验的重点。本实验以小鼠皮质骨微小骨片获得鼠MSC的培养方法，获得了大量的MSC，方法简单且重复性好。相同的获取MSC的方法见于人体松质骨骨片［8］。与从小鼠股骨骨髓腔获得 MSC不同，本方法通过多次冲洗髓腔，力求彻底减少造血等细胞的污染，将皮质骨切成微小骨块酶消化后置于培养液内，开始3 d内不需要换培养液，48 h可见骨片周围有成纤维样细胞，72 h可以观察到克隆形成，优于骨髓腔来源的MSC培养观察。这种方法可以在较短时间内获得大量（数量＞107）MSC细胞，并且培养过程中不需要额外添加细胞生长因子，渴望为今后实验研究小鼠MSC提供比较好的技术支撑。

端粒是位于真核细胞染色体末端的帽状结构，主要功能是稳定染色体，保护DNA。正常细胞每分裂一次，端粒都会缩短。端粒缩短限制了细胞的寿命，在衰老和慢性病过程中细胞的增殖能力下降，当端粒缩短到一定程度，染色体末端脱帽导致细胞衰老或凋亡。因为WT鼠的端粒长度是人类的五倍，所以建立3～6代以后的鼠，这时的端粒才会足够短，表型也容易观察［9］。通过建立观察端粒酶基因敲除鼠 G3（Terc-/-鼠第三代）的表型，发现Terc-/-鼠存在造血功能、成骨能力以及消化系统的明显衰老，骨骼器官的衰老主要原因可能来自MSC的功能异常，经过原代和传代培养观察，Terc-/-鼠MSC的增殖能力明显低于WT鼠。通过对MSC连续传代培养，结果显示，Terc-/-鼠MSC在经历了7代的传代培养以后MSC出现衰老征象，即细胞增生速度缓慢，多数细胞出现核固缩、核碎裂及由培养孔底面脱落等，这与许多其他种类细胞的体外传代培养的结局相似。因此有关这种衰老现象出现的机理有待于通过进一步实验阐明。此外，与原代培养生长曲线相比，传代细胞的生长潜伏期较短，每代铺满培养孔底面需要时间短于原代细胞，这种共性见于WT鼠和Terc-/-鼠。

组织发生生物学认为，MSC可以向所有的中胚层起源的组织细胞方向进行分化，这是涉及诸多机制和阶段的复杂过程［10］。已有报道通过MSC来修复骨组织、关节软骨组织的缺损大都建立在大动物基础上，如兔，羊，犬等，这些大动物骨髓内的 MSC数量虽然较多，能满足研究需要，但是面对日益复杂的疾病模型研究，大动物无法提供灵活而丰富的基因型，小鼠则具有这一优势，这无疑为MSC研究提供更佳选择。现在，我们成功建立小鼠的MSC体外分离培养方法，初步观察对比 G3WT鼠和G3Terc-/-鼠的MSC生长和增殖特征，以此为基础，为我们今后深入研究MSC的各项功能提供启发和指导。

［1］Sottile V， Halleux C， Bassilana F， et al. Stem cell characteristics of human trabecular bone-derived cells［J］.Bone.2002，30：699-704.

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［10］赵春华 主编.干细胞原理、技术与临床.北京：化学工业出版社，2006.63-68.