毛细管GC法测定南五味子多糖的单糖组成Δ

姚 丹，王宏军，杨嘉玉，雷明生（辽宁医学院，辽宁 锦州 121001）

毛细管GC法测定南五味子多糖的单糖组成Δ

姚 丹＊，王宏军#，杨嘉玉，雷明生（辽宁医学院，辽宁 锦州 121001）

Δ辽宁省教育厅科学技术研究项目（L2010256）

＊实验师。研究方向：药物分析与仪器分析。电话：0416-4672307。E-mail：yaodan88abc@163.com

#通讯作者：副教授，博士。研究方向：药物分析与饲料分析。电话：0416-4672096。E-mail：wanghj0312@yahoo.com.cn

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.23.18

目的：研究南五味子多糖中单糖的种类和组成比例。方法：以2moL·L－1硫酸溶液水解南五味子多糖，用吡啶溶解干燥的水解产物，硅烷化衍生；采用毛细管气相色谱法测定南五味子多糖的单糖组成：色谱柱为SE-30石英毛细管（30m×0.25mm× 0.25µm），进样口温度为220℃，检测器温度为230℃，柱温为195℃。结果：南五味子多糖中含有甘露糖、木糖、半乳糖、果糖、葡萄糖和半乳糖醛酸6种单糖成分，已确定的6种单糖的摩尔比为19.78∶2.75∶0.149∶1∶0.381∶0.127。结论：该方法简便、灵敏，可以准确测定出南五味子多糖中含有的各种单糖。

毛细管气相色谱法；大叶南五味子；多糖；单糖组成

多糖是生命代谢不可缺少的重要物质，是多个单糖或其衍生物聚合而成的大分子活性化合物。近年来研究表明，五味子多糖具有保肝[1]、抗衰老[2]、抗肿瘤[3，4]、调节免疫[5]、降血脂[6]、镇痛[7]等药理作用。一般来说，多糖所具有的药理活性是与其结构密切相关的[8，9]，故对多糖的单糖组成和摩尔比的测定是研究多糖性质的一项较为重要的工作。苯酚-硫酸法是常用的测量多糖总含量的方法[10]，而毛细管气相色谱（GC）法是目前测定多糖中单糖组成和摩尔比的常用方法。大叶南五味子（Kadsuramarmorata）属于五味子科南五味子属植物。前期研究表明，从该植物中制备的南五味子多糖（KPS）具有增强细胞免疫和体液免疫的作用[11]，但关于该植物中多糖的分离纯化和结构研究均未见报道。故本试验采用硅烷化衍生，用毛细管GC法测定了从大叶南五味子果实中分离到的KPS的单糖组成及摩尔比，以期为该植物的开发提供理论和试验数据，为其药理活性、作用机制的研究提供物质基础。

1 仪器与试药

GC-2010plus GC仪、氢火焰离子化检测器（FID）（日本岛津公司）；安瓿熔封仪（中南制药机械厂）；TG16-W微量高速离心机（湘仪离心机制造厂）；DHG-9245A电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；FA1004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。

大叶南五味子产于贵州，由贵州中医院馈赠并鉴定为真品。甘露糖（分析纯，天津虔诚伟业科技发展有限公司）；D（-）阿拉伯糖（生物试剂，上海晶纯试剂有限公司）；L-鼠李糖、D-核糖、D-木糖（生物试剂，上海惠世生化试剂有限公司）；D-果糖（生物试剂，北京奥博星生物技术责任有限公司）；半乳糖（生物试剂，郑州兴人精细化工有限公司）；葡萄糖（分析纯，天津市北方天医化学试剂厂）；D（+）-半乳糖醛酸（生物试剂，国药集团化学试剂有限公司）；甘露醇（郑州百合化工产品有限公司）；硫酸为高纯试剂，无水吡啶、六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷、碳酸钡（BaCO3）、无水乙醇均为分析纯。

2 方法

2.1 KPS的制备

精密称取大叶南五味子100 g，利用水提醇沉法提取多糖[12]，经三氯乙酸脱蛋白、活性炭脱色纯化[13]后得到KPS，备用。

2.2 多糖的水解

精密称取KPS 50.0mg，置于安瓿中，加入2moL·L－1硫酸溶液5m L，酒精喷灯真空封管，置于烘箱里以110℃水解8 h，取出冷却至室温后加入BaCO3粉末，静置过夜，待中和至中性，以10 000 r·min－1离心5min除去沉淀，取上清液，冷冻干燥后得到多糖水解产物，备用[14]。

2.3 标准单糖硅烷化衍生

分别称取9种标准单糖各5.0mg、内标物甘露醇2.0mg，60℃干燥至恒重，加入无水吡啶1m L，75℃溶解30m in，再加入0.6m L硅烷化试剂（六甲基二硅胺烷∶三甲基氯硅烷＝2∶1），摇匀[14]，60℃反应10m in，10 000 r·m in－1离心10m in后，取上清液，备用。

2.4 色谱条件

色谱柱：SE-30弹性石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25 µm）；检测器：FID；柱温：195℃；进样口温度：220℃；检测器温度：230℃；分流比：80∶1；载气：高纯氮气，流速：30m L·m in－1；进样量：1.0µL。

2.5 多糖衍生物的制备

称取10.0mg彻底干燥的水解产物与2.0mg甘露醇，按“2.3”项下方法衍生化，10 000 r·m in－1离心5m in后取上清液进行GC分析。以内标法定性分析KPS的化学组成。

2.6 相对校正因子和摩尔比的测定

2.6.1 相对校正因子 相对校正因子的计算公式为f＝（Wi×As）/（Ws×Ai）。式中，Wi为标准单糖的质量；Ws为内标物的质量；Ai为标准单糖的峰面积；As为内标物的峰面积[15]。

2.6.2 摩尔比 根据下列公式求得各单糖的摩尔数，即N＝（Ax×Mr）/（As×f）。式中，N为单糖的物质的量；Ax为单糖的峰面积；As为内标物的峰面积；f为该单糖的校正因子；Mr为该单糖的分子量[15]。进而求得多糖水解产物中的单糖摩尔比。

3 结果与分析

3.1 混合标准单糖衍生物GC分析

混合标准单糖中各单糖的定性是通过与每个单糖的保留时间作对比确定的。混合标准单糖衍生物的GC图见图1；各标准单糖的保留时间见表1。

图1 混合标准单糖衍生物的GC图Fig 1 GC chromatogram of m ixed standard monosaccharides derivative

表1 各标准单糖的保留时间（m in）Tab 1 Retention timeof standardmonosaccharides（m in）

由图1可知，采用硅烷化衍生法，只有葡萄糖和甘露糖对应一种衍生化产物，其他单糖则对应多个衍生物；各单糖与内标物能完全分开。在上述GC条件下，混合标准单糖中各种单糖衍生物均可以得到较好的分离。

3.2 KPS水解衍生化产物GC分析

在与混合标准单糖同样的反应和测定条件下，进行KPS水解产物硅烷化衍生物的毛细管GC分析。将样品的混合单糖衍生物色谱峰与标准单糖衍生物色谱峰经GC-solution软件比对，鉴定相应单糖的色谱峰，详见图2。

图2 KPS水解衍生化产物的GC图Fig 2 GC chromatogram sof hydrogen derivative from KPS

由图2可知，从大叶南五味子果实中获得的KPS含有甘露糖、木糖、半乳糖、果糖、葡萄糖和半乳糖醛酸；保留时间分别为12.730、14.723、15.264m in的峰为未知物峰。

3.3 KPS中单糖摩尔比的计算

根据单糖和内标物的峰面积，按照公式分别计算各种单糖标准品相对于内标物的校正因子。以KPS中各种单糖及内标的峰面积和单糖各自的校正因子来计算KPS中各种单糖的摩尔比。经过计算，得到KPS中已确定的6种单糖——甘露糖、木糖、半乳糖、果糖、葡萄糖和半乳糖醛酸的摩尔比为19.78∶2.75∶0.149∶1∶0.381∶0.127。

4 讨论

糖类衍生化后进行GC分析有多种方法，其中糖腈乙酸酯衍生物GC法具有衍生物制备简便、试剂易得等优点，而且每种单糖得到单一的色谱峰，这一点对未知结构多糖的分析是十分重要的。

分析多糖中的单糖组成，首要工作就是将多糖样品进行彻底的水解。因为如果水解效果不理想，多糖很难完全水解为单糖或者仅仅有很少部分水解，会导致样品水解衍生化产物在GC分析中峰值很小，从而影响多糖中含量较少的单糖的测定。通过对影响水解效果的各种因素的考察分析，笔者认为对于KPS的水解采用2moL·L－1硫酸溶液水解8 h较为合适。用BaCO3中和处理时借助超声波能极大缩短中和时间，减少BaCO3的消耗，离心除去沉淀可防止对样品的损耗。三氟乙酸（TFA）也可用于多糖的水解，但因其具有挥发性、腐蚀性，故本试验未选择TFA水解KPS。

笔者曾经对比了SE-30不锈钢柱和SE-30毛细管柱对单糖的分离效果，发现SE-30毛细管柱的分离效果较好，信号值高，且无需程序升温亦可使各种单糖较好的分离、测定。由于毛细管GC进样量少，容易带来体积误差，故笔者采用内标法进行分析测定，可以校正吸量误差并保留时间的重现性，使结果更为准确、可靠。

由于自然界中存在的单糖种类较多，有些单糖很难得到标准品，因此本试验只能确定出KPS中含有的6种单糖。图2中的另外3个峰可能为未知单糖或其他杂质，尚需进一步确证；但从GC分析结果来看，鼠李糖、阿拉伯糖和木糖等五碳糖比甘露糖和葡萄糖等六碳糖早出峰，因此可以推测未知3个峰如果是单糖则可能为五碳糖。

综上，该方法简便、灵敏，可以准确测定出南五味子多糖中含有的各种单糖。

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Analysis of M onosaccharides Com position in Polysaccharide fromKasura marmorataby Capillary Gas Chromatography

YAO Dan，WANG Hong-jun，YANG Jia-yu，LEIM ing-sheng（Liaoning Medical University，Liaoning Jinzhou 121001，China）

OBJECTIVE：To study the types and proportion of monosaccharides inKasura marmoratapolysaccharide.METHODS：K.marmoratapolysaccharide was hydrolyzed w ith 2 moL·L－1sulfuric acid.The dried hydroxlyslate was dissolved in pyridine，and derived by silane.Themonosaccharides inK.marmoratapolysaccharide were determ ined by capillary GC.The determ ination was performed on SE-30（30 m×0.25 mm×0.25µm）capillary column.Injection and detector temperature was 220℃ and 230℃ respectively.The column temperature was 195℃.RESULTS：K.marmoratapolysaccharide made up of six monosaccharides，such as mannos，exylose，galactose，fructose，glucose，galacturonic acid.The mole proportion of mannose-xylose-galactose-fructose-glucose-galacturonic acid was 19.78∶2.75∶0.149∶1∶0.381∶0.127.CONCLUSION：Themethod reported in this paper is simple and sensitive，which can be used for determ ination ofmonosaccharides composition inK.marmoratapolysaccharide.

Capillary gas chromatography；Kadsuramarmorata；Polysaccharide；Monosaccharides composition

R284.1；R917

A

1001-0408（2012）23-2158-03

2011-12-12

2012-02-05）