降解聚丁二酸丁二醇酯(PBS)微生物菌种的筛选及降解性的研究

王 蕾， 张 敏，李成涛， 王旭愿， 宋吉青

(1.陕西科技大学 教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室，陕西 西安 710021； 2.中国农业科学院 农业环境与可持续发展研究所, 北京 100081)

0 引言

脂肪族聚酯中聚丁二酸丁二醇酯(PBS)因其优良的热性质、机械加工性和降解性已成为当前生物降解材料中最有发展前景的高分子材料之一[1,2].由于生物降解是由微生物参与的，因此，材料在土壤中的降解性、微生物的降解机理和降解速度控制就受到了更多研究者的关注[3, 4].对于脂肪族聚酯的微生物降解大多是先从脂肪酶的作用开始的[5]，参与降解的脂肪酶主要来源于自然界中的细菌、真菌和放线菌，其资源十分丰富.

本研究团队在研究了陕西花园土壤中微生物降解PBS的基础上[6-8]，将此微生物进行驯化培养，分离出了不同种类的菌株，并使用其菌株对PBS进行了降解能力的研究，通过PBS薄膜降解前后的膜的表面形态、质量损失和力学性能的变化等评价了各类菌株的降解能力，研究目标微生物对PBS的降解效果，为陕西及西北地区废弃高分子材料的处理等环境污染治理问题提供理论依据和基础数据.

1 实验部分

1.1 原料及试剂

PBS树脂颗粒(Mn=2×105)，本研究室自制，使用前已纯化，溶剂法制膜并将其裁成1 cm×4 cm大小，使用前准确称重；氯仿和甲醇(分析纯)均购于西安试剂有限公司.

1.2 降解PBS菌种的驯化、分离、筛选

选择陕西花园深层土壤2 g置于盛有98 mL的无机盐培养基的锥形瓶中，曝气24 h，静置，上清液即是获得含有大量微生物的菌液.

将菌液在不同培养基中富集，分离筛选出其中的细菌、真菌和放线菌.按照微生物生长所需培养基种类的不同，所用的培养基分别为：LB(细菌)培养基、土豆(真菌)培养基和高氏合成1号(放线菌)培养基(3种pH值均为7.2～7.4).

采用无机培养液(pH=7.2)对富集后的菌种进行逐级驯化，最后一个周期的驯化液用于菌种的划线分离.从中筛选出生长较为旺盛的菌落并进一步纯化，直至培养基上长出单一的优势菌落.

将PBS膜浸入含有各种优势菌株的菌悬液中，在恒温水浴振荡器中进行降解.其中细菌降解实验控温37 ℃，真菌和放线菌28 ℃，pH均为7.0～7.2.降解20 d后，对降解后的PBS膜进行质量损失、拉力实验和降解液外观等进行比较，从而筛选出对PBS有降解能力的菌株.

1.3 筛选的微生物菌种对PBS的降解实验

用筛选出来的菌株按上述方法对PBS进行降解，周期30 d，6 d取一次样，每组样品做3个平行样，失重率取其平均值.同时在没有接种各类微生物的溶液中进行降解空白实验.质量损失率的计算公式如下：

D=(m0-mt)/m0×100% (1)

式中:m0为降解前膜的原始质量；mt为降解一定时间后膜的剩余质量.

通过偏光显微镜观察降解前后PBS膜表面形态的变化，从微观形态上进一步判断结晶形态的变化，分析各菌株对PBS的降解能力；通过拉力实验得到降解前后PBS膜断裂伸长率的变化从而对其力学性能进行考察.

2 结果与讨论

经过驯化、分离，最后纯化得到可降解PBS的3株细菌，4株放线菌和9株真菌.将筛选出来的3类菌分别进行PBS降解性初筛，发现筛选出的真菌对PBS普遍具有降解性，而细菌和放线菌对PBS降解性能相对较弱.因此，把具有较好降解效果的真菌代表PBSZ2#菌和PBSZ5#菌分别在培养液中对PBS薄膜进行了降解性的研究.

2.1 降解菌落的外观形态

图1 菌落的外观形态(a)PBSZ2#和(b)PBSZ5#

图1为PBSZ2#和PBSZ5#菌落的外观形态：PBSZ2#菌为黄绿色绒毛状；PBSZ5#菌为黄黑色状.但对这两种菌还只是初步的认定，菌的性质还在进一步的研究鉴定中.

2.2 PBS膜表面形态的变化

PBS薄膜经PBSZ2#菌和PBSZ5#菌降解后，偏光显微镜下的表面形态如图2所示.从图中可以看出降解前PBS膜的表面不是很光滑，但经PBSM2#菌和PBSZ5#菌降解后，PBS膜的表面都出现了不同程度的黑斑，尤其在PBSM2#菌的作用下更为明显，说明PBSM2#菌在对PBS的降解过程中侵蚀程度比PBSZ5#大.

图2 PBS膜在偏光显微镜下的表面形态(100×10) (a)降解前的膜与(b)PBSZ2#和(c)PBSZ5#侵蚀30d后的膜

2.3 降解过程中质量损失率的变化

PBS膜在PBSZ2#菌和PBSZ5#菌作用下的质量损失变化曲线如图3所示.PBS膜在PBSZ2#菌和PBSZ5#菌的作用下，质量损失都呈先上升最终趋于平缓，变化趋势一致.但30 d后降解的最大质量损失率分别为13.4%和7.9%，说明PBSZ2#菌的降解能力比PBSZ5#菌强，PBSZ2#菌为降解PBS的最佳菌株.

图3 PBS膜在PBSZ2#菌和PBSZ5#菌作用下的质量损失曲线

2.4 降解过程中溶液pH值的变化

由图4可知在PBSM2#菌和PBSZ5#菌作用下PBS膜降解过程中溶液pH值的变化.从图中可以看出PBSZ2#菌作用下的溶液pH值要高于PBSZ5#菌作用下的溶液，这与2.3的结果相一致，即PBSZ2#菌对PBS的降解效果优于PBSZ5#菌.这是因为随着真菌的生长代谢和PBS降解产物的增加，溶液pH值下降，呈酸性.溶液酸性越强，对真菌的生长代谢的抑制作用越明显，菌株的活性降低，对PBS的降解能力也随之下降.因此，PBSZ5#菌降解能力受到的抑制更明显，其降解PBS的质量损失较PBSZ2#菌弱.

图4 PBS膜在PBSZ2#菌和PBSZ5#菌作用下的溶液pH值变化曲线

2.5 断裂伸长率的变化

图5为在PBSZ2#菌作用过程中PBS膜断裂伸长率的变化曲线.

图5 PBS膜在PBSZ2#菌作用下断裂伸长率变化曲线

根据图3、5中PBSZ2#菌对PBS的降解，可以初步判断微生物对PBS膜的降解过程主要分为3个阶段，这与文献结论相一致[9]：在初始阶段(0～6 d)，质量损失较小，而PBS膜的断裂伸长率明显下降.这是由于5～7 d是真菌的生长期，真菌在生长过程中菌丝会附着在PBS膜表面并侵入到内部，造成聚合物薄膜的崩裂，这种变化有可能是真菌生长引起的聚合物分子链的无规断裂造成的，使得聚合物分子量下降，断裂伸长率变化较大.

在降解加速阶段(6～18 d)，菌的生长代谢加快，代谢过程中会产生一定量的脂肪酶，脂肪酶可作用于PBS的酯键.此时，PBS膜会在菌产脂肪酶的作用下降解，会有小分子降解产物从聚合物主体脱离出来，对PBS膜断裂伸长率的影响变化不大.

当进入最后阶段(18～30 d)，降解速率减慢.这是由于降解主要发生在非晶区，随着非晶区逐渐降解，聚合物的结晶度会有一定程度的升高，微生物进一步入侵受限制，降解速率逐渐变慢，由于非晶区部分逐渐减少，分子链柔性变差，所以断裂伸长率有所下降.

总体来说，由断裂伸长率的变化可以看出PBS膜的力学性能随降解时间的增加而降低.

3 结束语

经过对菌的初筛和复筛，真菌对PBS有降解能力，(PBSZ2#菌和PBSZ5#菌对PBS降解的最大质量损失率可分别达到13.43%和7.93%)，而细菌和放线菌对PBS的降解能力相对较弱.

通过PBSZ2#菌和PBSZ5#菌对PBS的降解研究表明：PBSZ2#菌的降解能力优于PBSZ5#菌；降解过程主要经过3个阶段，与真菌的生长周期有关；PBS膜的力学性能随降解时间的增加而逐渐下降.

[1] Davis G.Biodegradable packaging based on raw materials from crops and their impact on waste management[J]. Industrial Crops & Products，2001,23:147-161.

[2] G. Biresaw.Compatibility and mechanical properties of blends of polystyrene with biodegradable polyestersq[J]. Composites: Part A: applied science and manufacturing,2004,35:313-320.

[3] 张 敏. 溶剂对脂肪酶降解高分子量PBS及改性共聚物的影响[J].高等学校化学学报,2010,31(3):612-615.

[4] George Z.Synthesis, cocrystallization, and enzymatic degradation of novel poly(butylene-co-propylene succinate) copolymers[J].Biomacromolecules,2007,8:2 437-2 449.

[5] Mingliang D.Study on the enzymatic degradation of PBS and its alcohol acid modified copolymer[J]. Biodegradation, 2012, 23(1):127-132.

[6] 张 敏.不同成膜工艺对PCL结晶及微生物降解性能的影响[J].高分子材料科学与工程,2012,28(1):113-116.

[7] 王 蕾.土壤中降解PCL微生物菌种的筛选及降解性的研究[J].环境化学,2010,29(5):856-859.

[8] 李成涛. PBS基可生物降解材料对植物种子发芽及初期生长的影响[J].生态环境学报,2011,20(1):181-185.

[9] 肖 峰.影响聚丁二酸丁二醇酯降解性能的因素[J].高分子材料科学与工程,2011,27(7):54-57.