蜕皮甾酮对2型糖尿病大鼠肾组织氧化应激的影响

邹德平，许志忠，曹 灵，陈 秋

(1眉山市人民医院，四川眉山620010;2泸州医学院附属医院; 3成都中医药大学附属医院)

糖尿病肾脏疾病(DKD)是糖尿病(DM)最常见且严重的并发症，也是DM患者的主要死因之一。目前，在我国终末期肾功衰竭患者中DKD不断增加。因此，对DKD患者早期诊治尤为重要。研究发现，氧化应激在DKD的发生、发展中起重要作用，抗氧化应激是防治DKD的重要途径之一。研究表明，蜕皮甾酮有促进蛋白质合成、影响糖脂代谢、抗氧化应激等作用［1］。为探讨蜕皮甾酮防治DKD的可能机制，2010年11月～2011年6月，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD大鼠70只，6～7周龄，体质量140～160 g，由泸州医学院动物实验中心提供。蜕皮甾酮(昆明昌宁德康公司)，阿托伐他汀(辉瑞制药公司)，洛汀新(北京诺华公司)，链脲佐菌素(STZ，美国)。超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)试剂盒(美国)。

1.2 方法

1.2.1 2型糖尿病(T2DM)模型建立 将70只大鼠适应性喂养1周，采用随机数字表法将其分为T2DM建模组(建模组)60只和正常对照组(对照组)10只。对照组用普通饲料喂养，建模组用高脂饲料喂养，均8周。第9周时，所有大鼠禁食16 h，其中建模组、对照组分别腹腔注射STZ 25 mg/kg、枸橼酸—枸橼酸钠缓冲液5 mL/kg;第10周时，随机选择建模组48只，在禁食8 h过夜后，取尾静脉血检测空腹血糖(FPG)。FPG 7.8～15.6 mmol/L确定为T2DM建模成功。

1.2.2 动物分组及药物干预 采用随机数字表法，将48只T2DM建模大鼠分为A组、B组、C组、T2DM组各12只。建模第2天，前三组分别将蜕皮甾酮20 mg/(kg·d)、阿托伐他汀2 mg/(kg·d)、吡格列酮20 mg/(kg·d)加入生理盐水2 mL中灌胃，T2DM组、对照组用等量生理盐水灌胃。药物干预期间，各组均自由摄食、饮水。

1.2.3 标本制作 实验第15周末，各组禁食8 h过夜，收集8 h尿。继之用1%戊巴比妥溶液腹腔注射进行麻醉并固定于手术台，常规消毒后，开胸行心脏穿刺取血5～10 mL，置4℃冰箱保存;开腹经肾蒂取下肾脏，行冠状面正中剖开，将1/2肾脏置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定，24 h内经梯度乙醇脱水，制作石蜡包块。

1.2.4 血、尿指标检测 采用酶法检测FPG;全自动生化分析仪检测血清尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、血脂;免疫散射速率比浊法检测尿白蛋白(Alb)，计算尿肌酐清除率(Ccr)。

1.2.5 肾组织NOS、SOD、MDA检测 采用ELISA法准确称取各组肾组织0.1 g，匀浆后加PBS液1.0 mL，－20℃过夜;次日经两次冻融后行5 000 r/min离心，取上清液，分别按NOS、SOD、MDA试剂盒说明书操作。测得样品OD值，以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算标准曲线的直线回归方程;再根据样品OD值，计算样品的NOS、SOD、MDA值。

1.2.6 肾组织光镜检查 将各组石蜡包埋的肾组织蜡块切成4 μm厚切片，用HE染色后，在光镜下观察其肾组织变化。

1.2.7 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，数据以s表示，两组间比较用t检验，多组间比较用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组BUN、SCr、FPG、Ccr比较 见表1。

2.2 各组血脂比较 见表2。

表1 各组BUN、SCr、FPG、Ccr比较(s)

表1 各组BUN、SCr、FPG、Ccr比较(s)

注:与对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与T2DM组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别 n BUN(mmol/L) SCr(μmol/L) FPG(mmol/L) Ccr(mg/g)对照组 10 6.50±0.63 31.40±4.69 6.70±0.53 19.19±6.93 T2DM组 12 10.04±0.65＊＊ 21.16±3.52＊＊ 12.87±2.71＊＊ 145.93±26.93＊＊A组 12 8.21±1.35＊▲▲ 27.19±2.17＊▲▲ 9.48±2.34＊▲▲ 46.33±12.96＊▲▲B组 12 8.89±0.89＊▲▲ 23.89±3.05＊▲ 12.32±2.12＊＊ 68.61±19.22＊▲▲C组 12 8.21±1.25＊▲▲ 28.77±2.56▲▲ 9.08±2.08＊▲▲ 51.46±16.81＊▲▲

表2 各组血脂比较(mmol/L，s)

表2 各组血脂比较(mmol/L，s)

注:与对照组比较，*P＜0.01;与T2DM组比较，▲P＜0.01

对照组10 1.32±0.06 0.66±0.03 1.04±0.06 0.66±0.04 T2DM组12 2.34±0.18* 2.27±0.11* 0.68±0.04* 1.12±0.06* A组 12 1.84±0.15＊▲1.70±0.18＊▲0.94±0.09＊▲0.86±0.09＊▲B组 12 1.37±0.17▲ 1.11±0.17＊▲0.98±0.06▲ 0.92±0.05＊▲C组 12 2.25±0.23* 2.21±0.15* 0.84±0.10＊▲1.08±0.06*

2.3 各组肾组织NOS、SOD、MDA比较 见表3。

表3 各组肾组织NOS、SOD、MDA比较(pg/mL，s)

表3 各组肾组织NOS、SOD、MDA比较(pg/mL，s)

注:与对照组比较，*P＜0.01;与T2DM组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别 n NOS SOD MDA对照组10 940±89.8 453±80.2 523±52.4 T2DM组12 1 636±116.9* 180±42.3* 1 393±76.7* A组 12 1 098± 52.7＊▲▲ 368±48.0＊▲▲ 958±60.6＊▲B组 12 1 423± 74.9＊▲▲ 289±48.3＊▲▲ 1 195±75.3＊▲C组 12 1 240± 72.1＊▲▲ 329±47.7＊▲▲ 1 145±75.3＊▲

2.4 各组肾脏及肾组织变化 与对照组比较，肉眼发现各建模组肾脏体积增大、颜色深，剖面皮质增厚;光镜下可见肾小球系膜细胞和肾小管细胞增生、肥大，胞质增多，胞核染色加深，毛细血管袢狭窄。上述改变以A组、C组较轻，B组较重，T2DM组最重。

3 讨论

DKD的确切发病机制尚未明确，目前认为，遗传、代谢、血流动力学变化、氧化应激、激素及多种细胞因子共同参与导致DKD发生、发展。研究表明，肾小球肥大是DKD最早且最明显的肾脏病理变化，微量白蛋白尿是其早期主要临床表现。DM患者尿微量白蛋白排泄增加，提示其肾脏血管内皮损害，是诊断早期DKD的金指标［2］。目前，防治DKD蛋白尿进展的主要手段是控制血糖、血压、血脂等。研究证实，血管紧张素转换酶抑制剂有独立于降压以外的肾脏保护作用，广泛用于DKD的防治。蜕皮甾酮是节肢动物产生的具有蜕皮活性的激素，以往我们研究发现，蜕皮甾酮可减轻T2DM大鼠的肾脏病理改变，降低其尿蛋白［3］。本次研究结果与其相似。

DM时机体处于氧化应激状态，常产生过多的氧自由基［4］。当活性氧簇生成增加而不能完全清除时，细胞内的一些不稳定分子(如脂质、蛋白质、DNA等)易被氧化，使其结构发生改变而造成功能异常。MDA是反映氧自由基脂质过氧化的指标之一，其在肾脏固有或由循环中的炎症细胞产生。检测DM大鼠的肾脏MDA，可了解其肾氧化应激情况［5］。SOD具有清除多种氧自由基的能力，检测其变化可间接反映机体的抗氧化能力。Bhatia等［6］报道，抗氧化治疗能减少DM大鼠的Alb排泄。Cai等［7］研究表明，蜕皮素具有抗氧化和清除自由基作用，口服蜕皮素0.1 mg/(kg·d)30 d以上可降低细胞膜的脂质氧化反应。本研究显示，与T2DM组比较，A组肾组织MDA明显降低，SOD明显升高;说明蜕皮甾酮可能通过增加肾组织SOD、减少MDA，减轻T2DM大鼠的肾组织氧化应激水平，发挥肾脏保护作用。

Prabhakar［8］报道，NO的代谢参与内皮依赖性血管舒张(EDVR)和组织损伤机制，EDVR作用减弱在DKD及其微血管并发症的发生、发展中起重要作用。体内NO生成的主要限速因素是NOS，临床上常根据患者的NOS水平判断其NO的分布和量。本研究显示，与T2DM组比较，A组NOS明显降低;表明蜕皮甾酮可能通过抑制早期DKD大鼠的肾组织NOS表达，起到肾脏保护作用。T2DM大鼠的特点是胰岛素抵抗及高脂血症并存，治疗上应改善胰岛素抵抗、降血脂。本研究显示，蜕皮甾酮可降低T2DM大鼠的血脂、FPG，减少Alb排泄及抗氧化应激，减轻肾脏损伤。提示蜕皮甾酮可能成为今后防治DKD的新型药物。

综上所述，在DM治疗过程中，除严格控制血糖、血脂外，定期检测血清SOD、MDA等，采取有效措施进行临床干预，对保护DM患者的肾损伤可能具有重要意义。

［1］邹德平，曹灵，陈秋.蜕皮素药理学作用的研究进展［J］.中国新药杂志，2008，17(5):371-374.

［2］Juliane I，Themis Z，Joiza LC，et al.Evaluation of tests for microalbuminuria SCr-eening in patients with diabetes［J］.Nephrol Dial Transplant，2005，20(5):2402-2407.

［3］邹德平，许志忠，曹灵，等.蜕皮甾酮对实验性糖尿病大鼠肾组织氧化应激的影响［J］.中国中西医结合肾病杂志，2010，11(1): 28-30.

［4］Iino K，Iwase M，Sonoki K，et al.Combination treatment of vitamin C and desferrioxamine suppresses glomerular superoxide and prostaglandin E production in diabetic rats［J］.Diabetes Obes Metab，2005，7(1):106-109.

［5］Lee EY，Lee MY，Hong SW，et al.Blockade of oxidative stress by vitamin C ameliorates albuminuria and renal sclerosis in experimental diabetic rats［J］.Med J，2007，48(5):847-855.

［6］Bhatia S，Shukla R，Venkata S，et al.Antioxidant status，lipid peroxidation and nitric oxide end products in patients of type 2 diabetes mellitus with nephropathy［J］.Clin Biochem，2003，36(7): 557-562.

［7］Cai YJ，Dai JQ，Fang JG，et al.Antioxidative and free radical scavenging effects of ecdysteroids from Serratula strangulate［J］.Can J Pharmacol，2001，80(12):1187-1194.

［8］Prabhakar SS.Role of nitric oxide in diabetic nephropathy［J］.Nephrol，2004，24(4):333-344.