短发卡RNA抑制人端粒酶逆转录酶表达对人脑胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响

张宏顺，马衍刚

(1开滦医疗集团钱家营医院，河北唐山063301;2聊城市人民医院)

胶质瘤是最常见的颅内原发性恶性肿瘤，胶质瘤内端粒酶的上调或重新激活是其无限增殖、生长、侵袭转移所必需的，人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的限速酶［1］。RNA干扰(RNAi)是生物体内抑制特定基因表达的一种现象，而短发卡 RNA (shRNA)可更明确、高效、稳定地干扰目的基因的表达［2］。2010年6月～2011年7月，我们设计针对hTERT的 shRNA表达质粒，转染人胶质瘤细胞U251，旨在探讨RNAi治疗胶质瘤的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料 pSilencer 1.0-U6载体(Line)，pSilencer 1.0-U6 GAPDH Control(Circular)，转染试剂Siport xp-1购自美国Ambion公司，T4DNA连接酶限制性内切酶(Promega公司)，胶质瘤细胞株U251。

1.2 方法

1.2.1 寻找针对hTERT合适的靶序列 采用BLAST软件对选择的靶序列进行同源分析，排除抑制其他基因片段的可能。3'端加入终止信号TTTTTT，两端分别加入ApaⅠ和IcorRⅠ的酶切位点，并加入LOOP环，克隆入pSilencer 1.0-U6质粒U6启动子的下游。hTERT靶基因(NM003219，nucleotides 745～765)序列为 5'-AAACGTGCCTTCAGCTAAGAA-3'。oligoA:5'-ACGTGCCTTCAGCTAAGAATTCAAGAGATTCTTAGCTGAAGGCACGTTTTTTT-3';oligoB:5'-AATTAAAAAAACGTGCCTTCAGCTAAGAATCTCTT-GAATTCTTAGCTGAAGGCACGTGGCC-3'。oligoA、B各取2 μL，退火、连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，提取质粒。酶切电泳鉴定，测序鉴定，扩增，－20℃备用。

1.2.2 质粒DNA/Siport xp-1转染U251胶质瘤细胞 脂质体与DNA比例为3 μL∶1 μg，分为空白对照组、hTERT干扰组、阴性质粒组，每孔细胞5× 105/L，分别于转染后1、3、5、7 d收集细胞，检验目的基因的活性。

1.2.3 hTERT基因表达检测 采用RT-PCR技术提取总RNA，使用两步法、RT-PCR试剂盒操作，引物由Invitrogen公司合成。hTERT上游引物5'-TCTACCGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'，下游引物5'-GCTCCCACGACGTAGTCCATGTTCA-3';GAPDH上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。PCR产物用1%琼脂糖电泳分离鉴定，凝胶成像仪显像。

1.2.4 hTERT蛋白表达检测 采用Western blotting技术收集细胞3×105/L，用磷酸盐缓冲液、PBS洗涤3次后，提取蛋白，测OD值。配制标准蛋白浓度(50 μg/μL)加上样缓冲液，100℃5 min变性;取样品45 μL上样于10%SDS-聚丙烯酰氨凝胶进行垂直电泳，湿转63 min。NC膜依次放入封闭液、一抗、二抗，加入7 mL NBT/BCIP显色剂，显色1 h后转移于双蒸水中，扫描成像。

1.2.5 细胞的增殖及凋亡检测 配PI-DNA荧光染色液，收集细胞5×105/L，PBS洗涤3次，4℃、75%乙醇固定过夜;加PI-DNA荧光染色液1 mL，4℃避光30 min，置流式细胞仪上检测细胞的增殖周期及凋亡率。增殖指数(PI)=G2M+S/G0G1+S+ G2M。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件，均数以s表示，组间比较采用单因素方差检验(ANOVA)。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 酶切鉴定结果 酶切后，目的质粒被切为3 000 bp和350 bp的两条片段，测序结果显示，插入序列与设计的shRNA碱基序列完全一致。

2.2 RT-PCR检测结果 凝胶电泳图显示，在转染后第3、5、7天hTERT PCR产物(202 bp)条带明显变细，亮度下降(与对照组比较)。利用ImageJ分析软件分析证明，U251胶质瘤中的hTERT基因呈高表达。shRNA对U251胶质瘤hTERT基因表达有明显抑制作用(P＜0.05)，在第3、5、7天抑制率分别为(77.00±14.23)%、(73.81±13.52)%、(71.52 ±15.87)%。

2.3 Western blotting检测结果 显色扫描成像后，第3、5、7天可见hTERT条带变淡。ImageJ分析软件分析证明，U251胶质瘤中hTERT基因呈高表达。shRNA对U251胶质瘤hTERT的表达有明显抑制作用(P＜0.05)，在第3、5、7天抑制率分别为(71.51± 21.33)%，(72.00±17.69)%，(69.23±13.46)%。

2.4 胶质瘤细胞增殖及凋亡情况 与对照组相比，hTERT干扰组细胞进入S期出现障碍，停滞在G0/ G1期的细胞增多，凋亡细胞增加。各组不同时间细胞PI及凋亡率比较见表1。

表1 各组不同时间细胞PI及凋亡率比较(s)

表1 各组不同时间细胞PI及凋亡率比较(s)

注:与空白对照组、阴性质粒组同指标比较，*P＜0.05

组别 第1天 第3天 第5天 第7天空白对照组PI 35.68±6.38 36.00±6.21 36.29±7.28 37.81±5.06凋亡率(%) 9.97±3.10 8.51±2.70 9.88±3.34 9.23±3.06阴性质粒组PI 37.73±7.19 35.09±4.60 37.85±8.83 38.68±5.98凋亡率(%) 8.90±3.70 7.12±2.97 10.40±4.10 10.71±2.91 hTERT干扰组PI 36.91±5.98 30.72±4.70 31.38±6.65 32.19±7.30凋亡率(%) 5.90±1.79*20.72±7.07*19.14±6.74*18.00±4.73*

3 讨论

脑胶质瘤具有高度侵袭性，在胶质瘤中端粒酶的阳性率随肿瘤恶性等级升高而相应增加［3］。研究表明，hTERT高表达能通过多分化刺激抑制细胞凋亡，导致细胞永生化。本实验证明，在胶质瘤细胞中，hTERT呈高表达，端粒酶的上调或重新表达、重新激活是胶质瘤无限增殖、生长、侵袭、转移所必需的，hTERT可作为基因治疗胶质瘤的理想靶点。

本实验将重组pSilencer1.0-U6-shRNA质粒转染胶质瘤细胞U251，结果显示，转染后第3天目的基因表达明显下降，直至转染后第7天，目的基因的干扰作用持续稳定。有学者曾使用反义技术、基因敲除技术、核酶切割技术成功地抑制了hTERT的表达，但都存在许多不足，因而限制了这些技术在实验和临床上的进一步应用［4］。shRNA是含siRNA的正义和反义链的一段序列，中间以7或9个 bp形成环状，使siRNA双链配对，在细胞内表达后可被DICER切割茎环产生双链siRNA，这样的shRNA载体能提供大量siRNA分子。所以shRNA干扰技术具有高度的特异性、普遍性，其沉默效率高、稳定性高、操作简单、重复性好［5］。

本实验检测了胶质瘤细胞的增殖周期分布与肿瘤细胞的凋亡率，结果显示，与对照组相比，目的基因干扰后的细胞进入S期出现障碍，停滞在G0/G1期的细胞增多。证明shRNA抑制了hTERT的表达，降低了端粒酶活性，抑制了细胞从G0期进入S期，激活了启动凋亡的某些基因，细胞凋亡增加。

RNAi的兴起使生物医学技术步入崭新阶段，“后基因组时代”对基因功能的分析离不开RNAi，因其沉默机制的广泛性、高效性和特异性，RNAi可能成为继单克隆抗体后又一次临床治疗手段的革命，目前探索RNAi治疗的研究多集中在感染性疾病和恶性肿瘤，随着shRNA特异、高效的细胞导入技术成熟，相信不久将看到shRNA成为一种新型药物而更多地用于临床治疗。

［1］陕声国，张端莲，余瑛，等.血管瘤组织中端粒酶逆转录酶基因表达与端粒酶活性的关系［J］.中华实验外科杂志，2004，21(6): 661-663.

［2］马衍刚，傅强，冯晶军，等.脑胶质瘤组织中靶向乏氧诱导因子-1α shRNA表达载体的构建与鉴定［J］.山东医药，2007，47 (15):30-31.

［3］刘平，卢亦成，夏放，等.脑胶质瘤端粒酶活性的表达及端粒长度的分析［J］.中华神经外科杂志，2000，16(5):316.

［4］Dillin A.The specifics of small interfering RNA specificity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(11):6289-6291.

［5］张峰，刘晔，刘三光，等.RNA干扰研究及其在肿瘤基因治疗中的作用［J］.中华实验外科杂志，2006，23(3):381-382.