甲醛固定石蜡包埋子宫内膜癌变组织中microRNA-29b表达及其临床意义

张海凤，王黎明，孙双双，刘世国，孙显璐

(青岛大学医学院附属医院，山东青岛266003)

microRNA是一类非编码小分子RNA，它在转录和翻译水平调节基因表达，参与生命过程中一系列重要进程，包括早期胚胎发育，细胞增殖、分化、凋亡，脂肪代谢及基因表达调控等。近年研究表明，很多microRNA(如microRNA-29)在肿瘤的发生、分化和发展中起重要作用。已有研究证明，microRNA-29b在多种人类肿瘤如肺癌、肝细胞癌、前列腺癌中表达下调［1，2］。microRNA-29有3种亚基，分别为microRNA-29a、microRNA-29b、microRNA-29c。本研究采用甲醛固定石蜡包埋组织为材料、以SYBR green实时荧光定量PCR方法检测microRNA-29b在子宫内膜癌变组织中的表达，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2007年1月～2008年7月在青岛大学医学院附属医院妇产科行手术治疗的96例患者的甲醛固定石蜡包埋处理组织，其中正常子宫内膜16例(增生期10例、分泌期6例)、不典型增生内膜20例、子宫内膜癌60例(子宫内膜样腺癌50例、腺鳞癌4例、透明细胞癌2例、浆液性乳头状腺癌4例)。三种子宫内膜组织患者的年龄及中位年龄分别为(30～48岁、39岁，42～59岁、51岁，45～72岁、58岁)，术前均未行放疗、化疗及内分泌治疗，术后均经病理检查确诊。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 依据Primer5.0软件基于Gen Bank和microRNA BASE(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences)数据库中人的U6和 microRNA-29b的序列，设计其带有茎环结构的特异性反转录引物和PCR扩增引物。microRNA-29b的特异性反转录引物为5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACACTGATT-3';PCR扩增上游引物为5'-GCGCGCTAGCACCATTTG-3';下游引物为5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。内参U6的特异性反转录引物为 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';PCR扩增上游引物为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下 游 引 物 为 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。以上引物均由上海生工公司合成。

1.2.2 总RNA提取 取厚10 μm的切片4张，放入1.5 mL的无菌离心管中，加入1 mL二甲苯颠倒混匀，50℃ 3 min彻底干燥后，按照Trizol总RNA提取试剂盒说明提取总RNA。纯化后的RNA分别用30 μL和60 μL的1‰ DEPC水溶解。分装20 μL用于检测RNA质量和反转录，其余置于－80℃保存备用。

1.2.3 RNA的纯度及质量鉴定 紫外分光光度计检测吸光度(OD值)，A260/A280比值1.8～2.1为高纯度RNA。采用1%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性。

1.2.4 microRNA-29b和内参U6的SYBR green实时荧光定量PCR检测 以RNA为模板，分别以microRNA-29b和U6的茎环结构反转录引物行逆转录反应，反转录条件为70℃ 5 min，42℃ 50 min，95℃5 min，获得组织的microRNA-29b和U6的cDNA。分别以microRNA-29b和U6的cDNA为模板，以microRNA-29b和U6的特异性PCR扩增引物行实时荧光定量PCR，反应参数为95℃ 3 min预变性，95℃15 s，60℃30 s，荧光检测1次，共40个循环。记录每个反应管中荧光信号到达设定域值时所经历的循环数，即Ct值。反应结束后，根据熔解曲线分析产物特异性，每组设3个复孔。

1.2.5 子宫内膜组织中microRNA-29b表达检测采用microRNA-29b SYBR green实时荧光定量PCR方法检测96例子宫内膜组织中的microRNA-29b表达。以2-ΔΔCt法计算正常及病变子宫内膜组织中的microRNA-29b表达量，U6作为内参照，各组织均与正常内膜microRNA-29b表达的均值进行比较，其中ΔΔCt=(CtmicroRNA-29b－CtU6)各组织－(CtmicroRNA-29b－CtU6)正常内膜均值。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，microRNA-29b表达数据用s表示。microRNA-29b表达水平与病变子宫内膜和子宫内膜癌临床病理特征的关系采用t检验或方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种子宫内膜组织中microRNA-29b、U6的Ct值及microRNA-29b表达 三种子宫内膜组织中U6的Ct值基本相近，而microRNA-29b的Ct值依次升高。两两比较，正常内膜与不典型增生内膜相比，P =0.248;正常内膜与子宫内膜癌相比，P=0.002;不典型增生内膜与子宫内膜癌相比，P=0.024。见表1。

表1 三种子宫内膜组织中microRNA-29b、U6的Ct值及microRNA-29b表达(s)

表1 三种子宫内膜组织中microRNA-29b、U6的Ct值及microRNA-29b表达(s)

注:与不典型增生内膜比较，aP＜0.05;与正常内膜比较，bP＜0.05

正常内膜16 22.155±1.011 21.373±0.961 1.013±0.160不典型增生内膜 20 22.576±0.789 21.697±0.762 0.949±0.163子宫内膜癌 60 23.118±0.889ab 22.004±0.684 0.825±0.222

2.2 microRNA-29b表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系 子宫内膜癌组织中microRNA-29b表达与病理分期有关，Ⅲ﹢Ⅳ期患者表达明显低于I﹢Ⅱ期患者(P＜0.05);在子宫内膜癌组织中microRNA-29b表达与有无淋巴结转移有关，有转移的患者表达明显低于无转移的患者(P＜0.05);与组织学分级、肌层浸润、是否绝经、雌激素受体表达、孕激素受体表达无明显统计学意义(P均＞0.05)。见表2。

3 讨论

现已证明，在多种肿瘤的发生、发展过程中存在microRNA的异常表达或缺失，microRNA与某些癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因相互作用，参与肿瘤的生成、发展及侵袭转移［3］。microRNA也可扮演癌基因或抑癌基因的角色［4］，参与肿瘤发展的某个阶段，如结肠癌演变中microRNA-29在不典型增生到腺瘤这一阶段起主要作用。microRNA在妇科肿瘤如上皮性卵巢癌中的表达研究虽然处于初级阶段，但已证明其确实存在microRNA-29异常表达，且microRNA表达具有组织特异性;其为microRNA-29在妇科肿瘤(如子宫内膜癌)中异常表达研究的可行性提供了可能。

表2 microRNA-29b表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系(s)

表2 microRNA-29b表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系(s)

临床病理因素 例数 microRNA-29表达 microRNA-29b Ct值 U6 Ct值P FIGO 分期Ⅰ+Ⅱ期 44 0.729±0.212 23.106±0.888 22.057±0.675 0.043Ⅲ+Ⅳ期 16 0.860±0.217 23.151±0.922 21.859±0.709组织学分级G1 39 0.837±0.246 23.196±0.923 22.088±0.653 0.569 G2+G3 21 0.802±0.169 22.972±0.825 21.847±0.728肌层浸润≤1/2 45 0.826±0.230 23.099±0.952 21.985±0.737 0.961＞1/2 15 0.822±0.201 23.172±0.691 22.061±0.508淋巴结转移无转移 52 0.854±0.218 23.099±0.914 22.040±0.680 0.007有转移 8 0.633±0.135 23.236±0.747 21.771±0.707绝经未绝经 6 0.936±0.196 22.241±0.569 21.333±0.411 0.200已绝经 54 0.813±0.223 23.215±0.868 22.078±0.667雌激素受体阴性 18 0.768±0.172 23.214±0.978 22.021±0.753 0.198阳性 42 0.849±0.237 23.076±0.858 21.996±0.662孕激素受体阴性 26 0.847±0.135 23.052±0.691 22.017±0.662 0.492阳性34 0.807±0.270 23.168±1.023 21.993±0.710

实时荧光定量PCR法已成为基因表达定量检测［5］的强有力工具，特别在定量低丰度的microRNA研究领域有很大的优越性。利用其研究microRNA在新鲜冰冻组织中的表达已经取得较多成果，然而自2006年关于甲醛固定石蜡包埋组织中microRNA表达变化的研究［6］问世以来，类似的报道仍然很少。其原因可能为RNA在固定和包埋过程中会降解、断裂成很多片段［7］或者发生严重的交联，从而限制了对甲醛固定石蜡包埋组织的使用。由于microRNA分子小且非常稳定，在甲醛固定石蜡包埋组织中的交联经过适当处理容易恢复，Jin等［8］通过组织蜡块进行microRNA检测大宗病例回顾性研究，认为甲醛固定石蜡包埋组织可用于针对microRNA的分析研究。基于其研究的可行性，本实验以SYBR green实时荧光定量PCR方法检测甲醛固定石蜡包埋组织中microRNA-29b的表达。

Iorio等［9］用SYBR green实时荧光定量PCR检测出microRNA-29b在乳腺癌中表达下调。妇科肿瘤研究表明，子宫肌瘤众多基因失调可造成microRNA异常表达，其中差异表达较显著的为microRNA-29b。最近刚公布了一些卵巢癌中具有标记意义的microRNA表达谱［10］;而Resnick等［11］还得出与已经公布的卵巢癌microRNA表达谱不一致的结果，即microRNA-29a呈过度表达。这些研究均表明，microRNA-29b在肿瘤组织中异常表达，其对肿瘤的发生、发展可能有一定影响。本实验结果显示，microRNA-29b在正常子宫内膜、不典型增生内膜及子宫内膜癌中的表达逐渐下调，且从正常内膜组织到癌组织的差异有统计学意义，说明microRNA-29b可能参与子宫内膜癌的发生过程，对子宫内膜癌的诊断可能具有一定价值，有望成为一个新的肿瘤标志物，但其可行性仍需要在血清学方面进一步研究。实验还显示，从不典型增生内膜到子宫内膜癌均出现microRNA-29b明显低表达，进一步表明microRNA-29b可能参与子宫内膜癌形成的早期事件，可能成为子宫内膜癌的早期诊断指标。MicroRNA-29b表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系显示，FIGOⅢ﹢Ⅳ期患者microRNA-29b表达明显低于Ⅰ+Ⅱ期，有转移淋巴结患者的microRNA-29b表达明显低于无转移者，说明随着临床病理分期升高，microRNA-29b表达下降;表明microRNA-29b在子宫内膜癌的发展过程中可能起重要的作用，其对子宫内膜癌患者的预后评估可能有一定的指导意义。当然，这种预后评估价值仍需大量相关方面的研究及长期的临床观察证实。

总之，本实验证实microRNA-29b在子宫内膜癌变过程中表达下调，其表达差异可能与子宫内膜癌的发生、发展有关，但microRNA-29b在癌变发生、发展过程中的作用及其作用机制仍待于进一步研究。

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