亚临界水法提取红三叶中的总异黄酮

尹立影，张永忠

(东北农业大学理学院应用化学系，黑龙江 哈尔滨 150030)

红三叶(Trifoliumpratense)主要活性成分是红三叶异黄酮。红三叶中的异黄酮有近40多种[1]，主要的4种异黄酮分别为芒柄花黄素(Formononetin)、鸡豆黄素(Biochanin A)、染料木黄酮(Genistein)和黄豆苷元(Daidzein)[2-5]。前两种异黄酮含量相对较高，据报道红三叶中芒柄花黄素含量为9. 65 mg·g-1，鸡豆黄素含量为10.22 mg·g-1[3]。一般大豆(Glycinemax)中异黄酮含量0.50～1.70 mg·g-1[6]，红三叶中总异黄酮含量是其他豆科植物的10～30倍[7]，远高于大豆中大豆异黄酮含量[8]。红三叶中含有的异黄酮主要以糖苷的形式存在，采摘后由于酶解或水解反应主要以苷元形式存在[9]。红三叶异黄酮有消炎[10]、抗癌[11]、抗肿瘤[12]、调节人体激素平衡、改善骨质疏松、缓解妇女更年期综合症[12]、防治高胆固醇血症、抗氧化、清除自由基、预防紫外线[13]等作用。红三叶生长季节长，分布广泛，产量高，而且重复修剪能刺激红三叶中异黄酮含量的增加[7]。红三叶异黄酮可从叶、茎、花中提取，而大豆异黄酮只能从大豆种子中提取。种植大豆需要优质的耕地，而红三叶对土壤的要求不高，可以不占用粮食资源和优质土地，因此，红三叶是获取异黄酮重要的可再生生物资源。

亚临界水又称热液态水、高压热水或过热水[14]。亚临界水提取法(Subcritical Water Estraction，SWE)是近期国内外较流行的一种提取方法，具有节省提取时间、萃取效率高、对环境友好等优点。其在高热高压下处理且不使用酸、碱和催化剂，用水作为溶剂，没有有机溶剂残留，能保留提取物不被氧化、活性不被破坏[15]，因此，也被称为“绿色的处理法”。利用亚临界水法提取红三叶中总异黄酮的研究在国内还未见报道，因此，本研究可为红三叶的工业应用提供价值。

1 材料与方法

1.1材料与仪器 红三叶来源于东北农业大学园艺站，室外种植，于花蕾期采全株，将其烘干后用高速万能粉碎机粉碎(FW型，天津市泰斯特仪器有限公司)。

纯品的芒柄花黄素和鸡豆黄素由Fluka公司生产，纯度99%；高纯氮气，购自北京市亚南气体有限公司，质量分数为99.999%。

TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、METTLER TOLEDO AG135型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)、LG10-2 4A型高速离心机(上海安亭科学仪器厂)、高压磁力搅拌反应釜(烟台高新区科立自控设备研究所)和真空旋转蒸发器(上海医械专机厂有限公司)。

1.2试验方法

1.2.1紫外分光光度法测定红三叶总异黄酮的含量 依据文献[16]测定红三叶总异黄酮的含量，红三叶异黄酮中主要含有芒柄花黄素和鸡豆黄素。取等比例芒柄花黄素和鸡豆黄素的混合溶液，用乙醇分别配制成总质量浓度为0、2、4、6、8 μg·mL-1的混合标准溶液，在253.5 nm下测定混合溶液吸光度，并绘制标准曲线。

1.2.2红三叶总异黄酮得率的计算

1.3红三叶异黄酮的亚临界水提取 将采回的红三叶全株烘干，经高速万能粉碎机粉碎，过0.45 mm筛备用。准确称取红三叶草粉4.000 0 g放入高压反应釜中，根据液固比例加入所需体积的蒸馏水，通入高纯氮气加压，磁力搅拌速度为160 r·min-1，进行亚临界水提取试验。

在以下4种条件下进行提取试验：1)在液固比、提取压力、提取温度分别为80 mL·g-1、0.8 MPa、120 ℃条件下，选取提取时间10、20、30、40和50 min进行提取试验；2)在液固比、提取时间、提取压力分别为80 mL·g-1、20 min、0.8 MPa条件下，选择提取温度为100、110、120、130、140 ℃进行提取试验；3)在提取时间、提取压力、提取温度分别为20 min、0.8 MPa、120 ℃条件下，选择水与红三叶草粉的液固比为40、50、60、70、80 mL·g-1进行试验提取；4)在提取时间为20 min、提取温度为120 ℃、液固比为50 mL·g-1的条件下，选择压力为1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 MPa进行试验提取。

提取液用热水漏斗趁热过滤，用乙醇定容适量提取液，按参考文献[16]在波长253.5 nm处测定其吸光度。根据标准曲线回归方程计算所得提取液中总异黄酮的含量。

2 结果与分析

2.1提取时间对红三叶总异黄酮提取效果的影响 当提取时间为20～30 min时，异黄酮得率明显升高，在30 min以后异黄酮得率有下降趋势。因此，最佳提取时间为20 min(图1)。

2.2提取温度对红三叶总异黄酮提取效果的影响 开始升温时，异黄酮得率随温度的升高而增大，当提取温度为120 ℃时，异黄酮的得率最高，随后下降(图1)。因此，120 ℃为单因素提取的最佳温度条件。

2.3液固比对红三叶总异黄酮提取效果的影响 当液固比为50 mL·g-1时，红三叶总异黄酮的得率最大(图1)。试验过程中发现，若液固比过小会有糊底现象发生；若液固比过大，会给后续纯化造成一定困难和不必要的能源浪费。因此，最佳液固比为50 mL·g-1。

2.4提取压力对红三叶异黄酮提取效果的影响 在1.0～1.4 MPa压力范围内，红三叶总异黄酮提取率随提取压力的增大而增大。当压力为1.4 MPa时，红三叶总异黄酮提取率最高，而后下降(图1)。因此，1.4 MPa为最佳提取压力。

2.5亚临界水提取红三叶中总异黄酮的正交试验 在单因素试验的基础上，对影响亚临界水提取红三叶中总异黄酮的各因素进行L9(34)正交试验设计(表1)，得出结果后进行统计分析，确定其工艺的最佳参数。

图1 提取时间、提取温度、液固比和提取压力对异黄酮提取效果的影响Fig.1 Influence of time，tempreture，liquid to solid ratio and pressure on isoflavone extraction

由极差分析结果可以看出，对红三叶总异黄酮提取效率影响的主要因素依次为B>C>A>D，即温度影响相对较大，其次为液固比、提取时间和提取压力。研究得到最佳组合为A1B2C1D2，即15 min、120 ℃、40 mL·g-1、1.4 MPa(表2)。

2.6验证试验 取红三叶草粉4.000 0 g，按照最佳工艺即15 min、120 ℃、40 mL·g-1、1.4 MPa条件进行试验，总异黄酮得率为33.61 mg·g-1，高于正交试验中的最大值，表明本试验所得出的最佳工艺为最佳提取条件。

表1 因素与水平Table 1 Factors and levels

表2 L9(34)设计Table 2 L9(34)Designandresultsof L9(34)orthogonal test

3 讨论与结论

温度越高分子运动速度越快，但长时间的高温可能会导致异黄酮的分解，或者由于红三叶中蛋白质变性形成的沉淀将原料包裹起来[17]，降低异黄酮的提取率，其具体原因有待于深入研究。加压提取与传统的加热回流提取相比提取效果更好。加压是液体介质在压力作用下的传递过程，不论提取物质是固体还是液体，都可受到均一的压力作用。通过升高温度和压力，增强溶剂对原料颗粒的穿透能力，从而加速溶剂的扩散，提高浸出速度和浸出率。同时，高压还能使溶剂在高于沸点的情况下仍保持液态，保证提取过程中溶剂的充分浸润。在封闭的系统中不增加压力，溶剂水不会达到较高温度，就不会产生亚临界水，所以增大压力是产生亚临界水的必要条件[18]。通入高纯氮气加压可以防止高温条件下红三叶异黄酮被氧化。

由单因素试验和正交试验结果可得，亚临界水法提取的较优条件为提取时间15 min、提取温度120 ℃、液固比40 mL·g-1、提取压力1.4 MPa，此时红三叶总异黄酮得率为33.61 mg·g-1。本研究采用目前较常用的亚临界水提取技术，水作为溶剂，通过温度、压力的持续升高使水处于亚临界状态[18]，水的极性和黏度都有所降低，从而增大红三叶总异黄酮在水中的溶解度，且高纯氮气加压还能够防止高温提取过程中异黄酮被氧化[19]，提高总异黄酮提取率。娄冠群等[20]采用亚临界水法提取香菇(Lentinusedodes)中多糖，王凤荣等[21]采用亚临界水法提取大豆胚芽中异黄酮，周丽等[17]采用亚临界水法提取葛根(Poerarialobato)中异黄酮。但国内利用亚临界水提取法提取红三叶总异黄酮的研究尚未见报道，本研究将亚临界水提取技术应用于红三叶总异黄酮提取上是科研方面的新探究，对红三叶总异黄酮的制备具有一定意义。

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