FQ-PCR检测小鼠肝癌模型中Cyclin E mRNA方法的建立

刘素娜，张 艳，张晶敏，韩 立，江金花，周玉冰，王庆端

(1.郑州大学基础医学院 河南郑州 450001;2.郑州大学医药科学研究院药化室 河南郑州 450052; 3.郑州大学药学院 河南郑州 450001)

细胞周期蛋白(cyclins)是参与细胞周期调控的主要因子［1，2］。Cyclin E蛋白是cyclins中调控细胞周期的重要蛋白质，其过表达可促进细胞周期由G1期向S期过渡，导致细胞增殖失控，促进细胞恶性转化和肿瘤发生。有研究证实，抑制cyclin E的表达可控制细胞恶性增殖、转化和肿瘤发展［3，4］。Cyclin E通过促进食管癌细胞增殖对食管癌发生发展起重要作用［5］，其蛋白的表达可作为判断肾透明细胞癌预后分子指标［6］。本实验采用以管家基因β-actin作为内参基因，绘制目的基因和内参基因的标准曲线，建立用SYBR Green I荧光定量PCR技术检测cyclin E表达方法，为肿瘤的发生发展机制研究及cyclin E靶点基因肿瘤治疗建立良好的相对定量测定 cyclin E mRNA表达的实验模型。

1 材料与方法

1.1 动物和细胞株 H22肝癌细胞株购自南京凯基生物技术有限公司。SPF KM小鼠15只，18～22 g，6～8周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK(湘)2009-0004。小鼠在温度20℃，湿度55%的IVC独立供风系统内进行常规饲养。

1.2 建立H22肝癌动物模型 收集传代第7～8天的H22肝癌细胞，用PBS洗两次，0.4%的台盼蓝染色进行细胞计数，将细胞浓度调至1.2×107/ml接种于KM小鼠右腋下，每只动物接种0.2 ml，18 d后剖瘤称重，将介于1.5～2.2 g瘤体的瘤体共12例－80℃保存备用。

1.3 荧光定量 PCR检测Cyclin E和β-actin mRNA的表达。

1.3.1 引物的设计与合成:应用NCBI数据库，查阅出cyclin E与β-actin的GenBank收录号分别为NM-007633.2和NM-007393.3，利用Primer5.0设计cyclin E引物，引物序列见表1。

1.3.2 瘤组织总RNA的提取及样品总RNA反转录用Trizol提取组织RNA，具体方法按照Trizol试剂盒说明书进行操作。将提取的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，用蛋白核酸测定仪测定提取的RNA浓度。总RNA的反转录过程按照TaKaRa的反转录试剂盒说明书进行操作，将反转录好的cDNA分装后－20℃保存备用。

表1 Cyclin E和β-actin PCR基因引物序列

1.3.3 标准曲线样品的制备:用反转录的 cDNA产物制作标准曲线样品，随机取提取的1例RNA样本，用总RNA的反转录试剂盒，进行cDNA合成。取反转录后样本的cDNA，进行10倍梯度稀释(100～10－7)，检测反应灵敏性，作为制作标准曲线的样品使用。

1.3.4 荧光定量PCR反应:采用荧光定量PCR法对cyclin E和β-actin进行检测。将 RNA反转录后的cDNA进行扩增10倍梯度稀释，即取cyclin E和β-actin cDNA(10－2、10－3、10－4、10－5、10－6)梯度稀释制作标准曲线，ddH2O作阴性对照。定量PCR反应体系:2 ×SYBR Green I Mix 10 μl，上、下游引物各0.8 μl，标准品cDNA 1 μl，加ddH2O 7.4 μl至20 μl反应体系。扩增条件:95℃ 预变性10 s;95℃变性5 s，Cyclin E和β-actin分别53℃、51℃退火20 s，72℃延伸15 s并读取荧光信号，40个循环，每步的温度转换速度是20℃/s;熔解曲线分析:95℃2 s，60℃40 s，以0.2℃/ s加热至95℃，冷却至40℃停止。反应结束用Roche LightCycler 1.5分析系统进行结果分析。

1.4 PCR产物特异性、重复性和精密度测量 对荧光定量PCR的熔解曲线进行分析，并将其扩增产物用2.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，检测PCR产物的长度和反应特异性。将 cyclin E和β-actin 10－4的 cDNA标准品平行操作6次，同时在6 d内分别测定，获得日间CV和批内CV。

2 结果

2.1 H22肝癌动物模型的建立 将接种瘤细胞的小鼠7天后进行解剖，取瘤体称重，瘤重在1.5～2.2 g之间，成功的建立了H22肝癌动物模型。

2.2 瘤组织总RNA的提取及PCR产物检测 将提取的瘤组织总RNA进行A260/280比值和琼脂糖凝胶电泳检测，A260/280的比值介于1.7～2.0之间，同时电泳图显示有明显的28 s、18 s和5 s带型，结果说明提取的总RNA纯度和完整性良好。如图1所示，扩增产物(图1A)为合成长度(74 bp)的目的基因片段，扩增产物(图1B)为合成长度(197 bp)的内参基因片段。

2.3 标准曲线的制备 分别取倍比稀释后(10－2、10－3、10－4、10－5、10－6)的cyclin E和β-actin的cDNA制作PCR扩增曲线、标准曲线和熔解曲线(图2，图3)。标准曲线r均为－1.00，说明模板浓度和Ct值相关性良好。二者的标准曲线斜率分别为slop=－3.499和slop=－3.572，PCR扩增效率E=10［－1/slop］－1，对应的扩增效率分别为0.91和0.93，扩增效率高且基本一致;熔解曲线为单峰，说明无引物二聚体生成;扩增曲线梯度良好。

图1 Cyclin E(A)和β-actin(B)PCR扩增结果

图3 β－actin荧光定量PCR扩增曲线(A)、标准曲线(B)和熔解曲线(C)

2.4 PCR产物的特异性、重复性与精密度 Cyclin E和β-actin扩增产物对应的Tm值分别为(81.84± 0.28)℃和(89.15±0.26)℃，熔解曲线均呈单峰，说明无引物二聚体生成。SYBR Green I荧光定量PCR方法检测Cyclin E 10－4cDNA的标准品的批内和日间Ct值的均值分别为28.37和 28.26，标准差分别为0.29和0.41，批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.02%和1.45%;β-actin 10－4cDNA的标准品的批内和日间Ct值的均值分别为21.07和21.01，标准差分别为0.19和0.31，批内CV和日间CV分别为0.90%和1.48%。

3 讨论

实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术诞生于九十年代中期，因其定量准确，检测范围宽，敏感性高，精确度高，无PCR后处理步骤，产出率高且可以进行多重检测的优点［7］，目前已广泛应用于分子生物学等诸多研究领域。FQ-PCR的荧光探针法主要有两大类，一类是非序列特异性荧光染料SYBR Green I法，另一类是可以与目的DNA特异结合的TaqMan探针法。虽然TaqMan探针具有较高的特异性，在许多研究应用中序列特异的荧光探针(如TaqMan)被看作是标准的检测模式［8，9］，但其合成探针费用昂贵，所以它不适合用于对大量不同基因序列进行定量。SYBR Green I是一种价格低廉的荧光素，它能够非特异嵌合于DNA双螺旋结构中，结合状态的发射荧光。应用SYBR GreenⅠ的荧光定量PCR方法经济，只需合成序列特异引物。其自身的特异性相对较差及易受引物二聚体影响的缺点，通过摸索优化反应条件，并用熔解曲线和凝胶电泳证实并克服。所以本研究选择用SYBR Green I作为荧光染料，试图建立一种方便快捷、特异性高且成本较低的基因定量检测方法。

本实验采用将RNA反转录产物进行扩增得到的cDNA 10倍梯度稀释，成功的建立了目的基因和管家基因的双标准曲线，不需要构建质粒制作标准曲线，在降低实验成本缩短实验周期的同时，避免了用胶回收基因片段或质粒载体构建基因片段由于与目标cDNA结构不同所带来的扩增效率不一致现象。荧光定量PCR的模板定量分相对定量和绝对定量。定量PCR并非完全是测定基因的绝对数量。本研究是采用相对双标准曲线进行定量分析，选取管家基因β-actin作为参比基因来对所用样品进行归一化处理［10］，计算在一定样本中目的序列相对于另一参照样本量的变化量。本实验建立的双标准曲线法cyclin E基因荧光定量PCR检测方法标准品的制备方便易得，降低了实验成本同时较大的减少了系统误差。

总之，本文建立的检测小鼠肝癌模型cyclin E mRNA相对表达水平的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方便快捷、经济实惠、灵敏度高、特异性好，为cyclin E的进一步研究奠定方法学基础，同时可以推广应用于到肿瘤学基础领域相关基因定量研究。

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