荧光原位杂交技术检测对复发性膀胱癌的诊断价值

葛永超，冯金顺，郭立恒，吴书一，袁志浩，郑 涛，王道协

(1.郑州市第三人民医院 泌尿外科 河南 郑州 450000;2.邓州市第一人民医院 外科 河南 邓州474150)

尿路上皮癌尤其是膀胱癌术后复发率高，在术后随访中如何进行早期复发检测是泌尿外科领域目前研究的热点问题。2008年12月至2011年12月，对膀胱癌术后随访49例患者，应用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)分析尿液遗传学改变，探讨遗传学改变与膀胱癌复发的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 经尿道膀胱肿瘤电切或者钬激光切除术后患者49例。男27例，女12例，年龄35～75岁，中位年龄53岁。入组时随访3～10个月，膀胱镜检查未见肿瘤复发，同时尿细胞学检查、FISH检查均为阴性。收集20例正常人新鲜晨尿，建立FISH检测的阈值。所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法 膀胱镜、FISH技术和尿脱落细胞学方法。1.2.1 膀胱镜检查:由经验和技术水平相当的医师进行膀胱镜检查。

1.2.2 尿细胞学检查:收集清晨第1次尿50 ml，尿液排出后1～2 h内涂片并立即固定，由病理科固定医师进行。

1.2.3 FISH检测方法:FISH技术使用的3、7、17号染色体着丝粒探针和9p21区带探针购自北京金菩嘉医疗科技有限公司。

1.2.3.1 标本收集与处理:收集怀疑膀胱肿瘤复发患者晨尿200～300 ml，经离心、去杂质、胃蛋白酶消化、变性［(76±1)℃水浴锅中］、杂交、洗涤、复染等试验步骤处理。

1.2.3.2 FISH结果观察:参照葛永超［1］方法进行。即在日本OLYMPUS-BX51荧光显微镜下，选用合适的滤波片观察荧光信号和杂交效果，以细胞核中有杂交信号的细胞≥75%为有效标本，对有效标本进行计数、摄图保存。

1.2.3.3 阈值建立和结果判定:参照葛永超［1］方法进行。对照组20例标本，按上述方法进行FISH实验，每份标本每个探针组合计数100个膀胱上皮细胞，统计出现不同类型异常情况细胞数目、正常细胞数目的百分比，建立参考阈值，阈值=平均值+3倍标准差。检测指标大于阈值，判定该指标阳性，小于阈值判定该指标阴性，等于阈值应加大样本细胞计数以确定最后结果。两种或两种以上染色体出现异常或同一染色体出现出现两种以上异常，提示膀胱癌细胞的存在。

1.4 统计学分析 采用SPSS13.0统计学软件进行统计学处理，计数资料采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

本组49例患者，随访3～36个月，平均25.9个月。确诊为膀胱癌术后复发患者31例(63.3%)。尿液细胞学检查、FISH技术检测、膀胱镜检查均未发现复发患者18例(36.7%)。31例复发患者中，尿细胞学检测12例为阳性(敏感性为38.7%)，FISH技术检测26例阳性(敏感性为83.9%)，敏感性明显高于尿脱落细胞学检查见表1。所有FISH技术和尿脱落细胞学检查发现膀胱肿瘤患者均经膀胱镜检查和病理诊断证实膀胱癌复发，故FISH技术和尿脱落细胞学检查的特异性均为100%。FISH技术检测阳性的患者中，G3级肿瘤12例，G2级肿瘤8例，G1级肿瘤6例;尿液细胞学检查结果发现G3级肿瘤8例，G2级肿瘤4例，无G1级肿瘤阳性病例。

表1 尿细胞学及FISH组检测膀胱癌敏感性比较

3 讨论

目前，膀胱镜和尿脱落细胞学检查是最常用的两种检测膀胱癌的手段。然而，膀胱镜是一种有创检查，给病人带来一定的痛苦，而且膀胱镜检查的假阴性率为10%～30%［2］，传统的尿脱落细胞学检测虽然具有比较高的特异性，但是细胞学检查的敏感性却很低，尤其对低级别尿路上皮癌的检测其敏感性更差。因此，为了更好地预测患者复发和病程进展的风险程度，更早地检测肿瘤复发，需要敏感性更强的辅助检测方法。近年来的分子遗传学研究发现9号染色体的部分或全部丢失与膀胱癌的早期发生密切相关;3、7、l 7号染色体的非整倍性与膀胱癌的发展密切相关。临床研究显示，对尿液中脱落细胞进行以上遗传学改变的检测对膀胱癌的早期诊断及预后评估具有重要意义，尤其对早期尿路上皮癌患者有辅助诊断作用，其敏感性高于细胞形态学检测，特异性则与细胞形态学检查相当［1，3］。

目前，针对以上所述的遗传学改变而建立的检测方法，即FISH技术，逐渐被欧美国家用于膀胱尿路上皮癌的早期诊断及术后监测。目前，FISH技术已经被美国FDA批准用于临床膀胱癌早期检测及预后监测。Kipp［4］采用该方法监测膀胱癌的复发，37例表浅性膀胱癌接受BCG膀胱内灌注后，12例FISH结果阳性的患者均有肿瘤复发，认为多色FISH可作为监测膀胱癌腔内灌注治疗后复发的一种有效方法。Fdedrich［5］比较了多色FISH、BTA stat、NMP22等方法，认为三者敏感性相似，但特异性上多色FISH明显高于其他两种方法，且不受血尿、尿路感染及膀胱内灌注等影响。本组复发的膀胱癌患者敏感性为83.9%，而尿细胞学检查的敏感性为38.7%，FISH技术检测膀胱癌与尿细胞学检查的敏感性差异有统计学意义。

FISH的一个重要特征是在膀胱镜诊断膀胱癌复发之前已检测出阳性结果。国外学者研究发现，FISH阳性常较膀胱镜出现异常提前平均约6个月［6］。Zell-weger等［7］报道FISH检查阳性组患者在中位为20.4个月的随访时间内出现膀胱癌复发的发生率是39%，而FISH检查阴性组复发率是21%。Sarosdy等［6］报道了36例膀胱镜检查阴性而FISH阳性者，在随访3～16个月(平均6个月)有15例(42%)确诊为膀胱癌，而68例膀胱镜检查阴性、FISH阴性在随访3～19个月(平均11.2个月)只有13例(19%)确诊为膀胱癌。于是Sarosdy提出一个术语“预期阳性”来反映一个事实，即FISH能在膀胱镜发现可见肿瘤之前发现几乎一半复发膀胱癌。Yoder等［8］随访了250例膀胱癌术后患者，发现211例膀胱镜阴性的患者中，有56例FISH阳性，即约27%的患者出现预测阳性，其中35例(62.5%)出现复发。本组患者在FISH检测阳性后的6～24个月均出现肿瘤复发，预测阳性率达到100%，较国外观察结果高，可能是由于观察病例少，病例偶然过于集中有关。但是，FISH技术对于监测膀胱癌术后复发的敏感性达到83.8%，较尿细胞学检查高，是膀胱癌复发的有效检测方法。

［1］ 葛永超，吴书一，冯金顺，等.荧光原位杂交技术检测尿液脱落上皮细胞染色体畸变对膀胱癌的诊断价值［J］.中国实用医刊，2011，38(1):4-9.

［2］ Hungerhuber E，Stepp H，Kriegmair M，et al.Seven years experience with 5-amin olevulinic acid in detection of transitional cell carcinoma of the bladder［J］.Urology，2007，69(2):260-264.

［3］ Hajdinjak T.UroVysion FISH test for detecting urothelial cancers: Meta-analysis of diagnostic accuracy and comparison with urinary cytology testing［J］.Urol Oncol，2008，26(6):646-651.

［4］ Kipp B R，Karnes R J，Brankley S M，et a1.Monitoring intravesical therampy for supericial bladder cancer using fluorescence in situ hybridization［J］.J Urol，2005，173(2):40l-404.

［5］ Friedrich M G，Toma M I，Hellstern A，et a1.Comparison of multitarget fluorescence in situ hybridization in urinne with other noninvasive tests for detecting bladder cancer［J］.BJU Int，2003，92(9): 911-914.

［6］ Sarosdy M F，Schellhammer P，Bokinsky G，et al.Clinical evaluation of a multi-target fluorescent in situ hybridization assay for detection of bladder cancer［J］.J Urol，2002，168(5):1950-1954.

［7］ Zellweger T，Benz G，Cathomas G，et al.Multi-target fluorescence in situ hybridization in bladder washings for prediction of recurrent bladder cancer［J］.Int J Cancer，2006，119(7):1660-1665.

［8］ Yoder B J，Skacel M，Hedgepeth R，et a1.Reflex UroVysion testing of bladder cancer surveillance patients with equivocal or negative urine cytology:a prospective study with focus on the naturahistory of anticipatory positive findings［J］.Am J Clin Pathol，2007，127(2): 295-301.