ε－聚赖氨酸复合防腐剂对常见致病菌和污染菌的抑制作用

莫树平王惠惠柏建玲

张菊梅1，2，3，4吴清平1，2，3，4丘明泉1，2，3，4

（1.广东省微生物研究所，广东 广州 510070；2.广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东 广州 510070；3.广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州 510070；4.广东省华南应用微生物重点实验室－省部共建国家重点实验室培育基地，广东 广州 510070）

ε－聚赖氨酸是一种具有抑菌功效的多肽，由25～30个赖氨酸残基聚合而成。ε－聚赖氨酸具有优良的抑菌效果，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌作用，并且对一些耐热性芽孢杆菌和病毒也有一定抑制作用。同时，ε－聚赖氨酸还具有热稳定性好、水溶性强、安全性高、不影响食品风味等特点［1－3］。

乳酸链球菌、纳他霉素是中国卫生部正式批准使用的食品防腐剂，安全健康、抑菌效果好，但两者抑菌谱相对较窄，ε－聚赖氨酸抑菌谱广、水溶性强、安全性高，三者复配使用，抑菌效果增强，抑菌谱互补，扩展了抑菌谱，有很大的开发应用前景［4］。目前，ε－聚赖氨酸在日本、韩国、美国等已经批准作为新型生物食品添加剂使用，广泛应用于肉类［5，6］、家禽、海产品、面包、米饭、蛋糕、饼干［7］、饮料［8］、酱油等食 品中。而中国相关法律法规尚不完善，ε－聚赖氨酸尚未列入食品添加剂目录［9，10］。

本研究团队的前期研究工作表明［11－13］，以ε－聚赖氨酸为主要防腐剂，与乳酸链球菌素和纳他霉素进行复配优选得到的生物防腐剂，对广式腊肠、禽畜鱼类、生鲜肉等食品中的常见污染菌均有良好的防腐效果。

本试验选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等致病菌和酵母、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉等食品中常见污染菌，采用纸碟法，有针对性的进行抑菌试验，评估复合生物防腐剂对这些常见致病菌的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

乳酸链球菌素（Nisin）：食品级，广东大地食用化工有限公司；

纳他霉素：食品级，广东大地食用化工有限公司。

1.1.2 试验菌株

大肠 杆 菌（Escherichia coli，8099）、金 黄 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）、白色念珠菌（Candida albicans，ATCC10231）、枯 草 芽 孢 杆 菌（Bacillus subtilis，ATCC9372）、黑曲菌（Aspergillus niger，ATCC16404）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC15442）、清酒酵 母 （Saccharomy ces sake，ACCC20045）、嗜 酸 乳 杆 菌（Lactobacillus acidophilus，ATCC4356）：广东省菌种保藏与应用重点实验室。

1.2 试验方法

1.2.1 试验准备 将指示菌菌种接种于试管斜面培养基上，37 ℃培养24h，转接两次将菌种活化，菌种活化后，接入液体培养基，37 ℃振荡培养24h，制备菌悬液；称取乳酸链球菌素、纳他霉素与ε－聚赖氨酸，用去离子水配制成2%浓度的配方溶液；用打孔器制作直径0.6cm 的圆形滤纸片。

1.2.2 乳酸链球菌素、纳他霉素与ε－聚赖氨酸的抑菌试验

采用纸碟法，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、黑曲菌、铜绿假单胞菌、酵母菌和乳酸菌为指示菌，取0.1mL指示菌菌悬液于培养基平板，用灭菌刮铲涂布均匀，放置浸泡过浓度2%的乳酸链球菌素、纳他霉素和ε－聚赖氨酸溶液的圆形滤纸片，37 ℃恒温培养24h，观察抑菌圈的有无，初步评估抑菌效果。

1.2.3 复合生物防腐剂的抑菌试验 以ε－聚赖氨酸为主要原料，按一定比例添加Nisin、纳他霉素等复配制成复合生物防腐剂，前期通过预试验获取了抑菌效果较佳的9 个配方（见表1），采用纸碟法，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、黑曲菌、铜绿假单胞菌、酵母菌及乳酸菌为指示菌，取0.1mL指示菌菌悬液于培养基平板，用灭菌刮铲涂布均匀，放置浸泡过2%复合生物防腐剂的圆形滤纸片，以空白圆形滤纸片作对照，37 ℃恒温培养24h，观察抑菌圈的有无，初步评估抑菌效果。

表1 复合生物防腐剂各复配组配方Table 1 Complex biological preservatives formula／（g·kg－1）

1.2.4 ε－聚赖氨酸、乳酸链球菌素、纳他霉素及复合生物防腐剂的抑菌试验 采用纸碟法，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌、黑曲菌、铜绿假单胞菌、酵母菌和乳酸菌为指示菌，取0.1mL 指示菌菌悬液于培养基平板，用灭菌刮铲涂布均匀，放置分别经2%的乳酸链球菌素、纳他霉素、ε－聚赖氨酸及复合生物防腐剂溶液浸泡过的圆形滤纸片，37 ℃恒温培养24h，测量抑菌圈的直径，评估比较各防腐剂的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 乳酸链球菌素、纳他霉素与ε－聚赖氨酸的抑菌效果

由表2可知，乳酸链球菌素能有效地抑制革兰氏阳性细菌如金黄色葡萄球菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌的生长，但对革兰氏阴性细菌如大肠杆菌、铜绿假单胞和酵母菌等没有抑菌效果；纳他霉素能有效地抑制革兰氏阴性细菌大肠杆菌、真菌白色念珠菌、黑曲霉和酵母菌的生长，但对阳性细菌没有抑制效果；ε－聚赖氨酸对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌与革兰氏阴性细菌大肠杆菌、铜绿假单胞菌及真菌白色念珠菌、黑曲霉和乳酸菌均有抑菌效果。

2.2 复合生物防腐剂的抑菌效果

由表3可知，复合生物防腐剂对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌与革兰氏阴性细菌大肠杆菌、铜绿假单胞菌及真菌白色念珠菌、黑曲霉和乳酸菌均有抑菌效果。与乳酸链球菌素、纳他霉素、ε－聚赖氨酸相比，复合生物防腐剂的抑菌效果得到互补，抑菌谱拓宽。

2.3 ε－聚赖氨酸、乳酸链球菌素、纳他霉素及复合生物防腐剂的抑菌效果

ε－聚赖氨酸、乳酸链球菌素、纳他霉素及复合生物防腐剂的抑菌效果见表4。

表2 乳酸链球菌素、纳他霉素与ε－聚赖氨酸的抑菌效果Table 2 Nisin，Natamycin andε－polylysine bacteriostasis effect

表3 复合生物防腐剂的抑菌效果Table 3 The bacteriostatic effects of complex biological preservatives

表4 各防腐剂的抑菌圈直径Table 4 The antiseptic antibacterial circle diameter ／cm

由表4可知，相比各单体防腐剂，乳酸链球菌素、纳他霉素与ε－聚赖氨酸的复配扩展了抑菌谱，复合生物防腐剂对指示菌中的革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均表现出了抑菌作用；单体防腐剂的复配同时也加强了抑菌效果，复合生物防腐剂4、5、7对乳酸菌的抑菌圈直径达到了1.8cm以上，复合生物防腐剂9 对白色念珠菌的抑菌圈直径为1.7cm，明显强于其它防腐剂的抑菌效果。

3 讨论

乳酸链球菌素是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂，能有效抑制革兰氏阴性菌，对革兰氏阳性菌、霉菌等无效；纳他霉素是一种天然、广谱、高效安全的真菌抑制剂，常用于食品的表面防腐；聚赖氨酸是一种具有抑菌功效的多肽，具有抑菌谱广、水溶性好、安全性、抑菌范围广等特点。3种防腐剂复配后的复合生物防腐剂扩展了抑菌谱，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌都表现出了显著的抑菌作用。

单体防腐剂的复配不但扩展了抑菌谱，而且增强了对指示菌的抑菌作用。复合生物防腐剂3、4、7对乳酸菌的抑菌效果明显强于其它单体防腐剂及复配组合，复合生物防腐剂7对乳酸菌的抑菌圈直径为2.2cm，明显大于乳酸链球菌素和ε－聚赖氨酸对乳酸菌的抑菌圈直径1.6，1.2cm。

ε－聚赖氨酸安全、易分解，不仅在食品业有广泛的应用，在医药、环保等领域的应用也有不断拓展。目前，ε－聚赖氨酸在日本已经实现产业化生产，中国尚处于实验室研发阶段。筛选产ε－聚赖氨酸的高产菌株，提高ε－聚赖氨酸的产量，实现产业化生产将是今后的重点研究工作。

1 Shih I L，Shen M H，Van Y T.Microbial synthesis of poly（ε－lysine）and its various applications［J］.Bioresource Technology，2006（97）：1 148～1 159.

2 Najjar M B，Kashtanov D，Chikindas M L.Natural antimicrobialsε－poly－L－lysine and nisin A for control of oral microflora［J］.Probiotics ＆Antimicro.Prot.，2009（1）：143～147.

3 刘德雄，陈中.复合添加剂对金黄色葡萄球菌的抑制效果研究［J］.现代食品科技，2011，27（12）：1 443～1 445，1 460.

4 吴慧清，吴清平，张菊梅，等.壳聚糖复合防腐剂对新鲜猪肉冷藏的保鲜效果［J］.食品与机械，2012，28（3）：211～213.

5 刘骁，谢晶，林永艳.复合生物保鲜剂对猪肉保鲜的研究［J］.食品与机械，2011，27（6）：199～203.

6 马涛，周大宇.ε－聚赖氨酸对月饼表皮防腐效果的研究［J］.食品科学，2008，29（12）：215～218.

7 程涛，吴超，岳喜庆.聚赖氨酸在食醋防腐中的应用［J］.农业科技与装备，2008（3）：71～73

8 李昆仑，李江阔，张鹏，等.ε－聚赖氨酸在食品中应用的研究进展［J］.保鲜与加工，2010（1）：11～15.

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10 江秋安.天然食品保鲜剂及其应用［J］.江苏食品与发酵，2000（3）：36～38.

11 张菊梅，石立三，吴清平，等.复合防腐剂对几种常见畜禽鱼肉的防腐效果研究［J］.现代食品科技，2009（10）：1 174～1 176.

12 莫树平，张菊梅，吴清平，等.ε－聚赖氨酸复合生物防腐剂对广式腊肠的防腐效果研究［J］.食品研究与开发，2010，31（12）：224～229.

13 莫树平，林苑苑，张菊梅，等.生鲜肉类复合生物防腐保鲜剂的开发研究［J］.食品科技，2011，36（12）：124～127，131.