淀粉样蛋白在阿尔茨海默病中的作用及机制研究

王爱霞，王瑞婷

(承德医学院药理学教研室，河北承德 067000)

淀粉样蛋白在阿尔茨海默病中的作用及机制研究

王爱霞，王瑞婷△

(承德医学院药理学教研室，河北承德 067000)

淀粉样蛋白;阿尔茨海默病;氧化应激;细胞凋亡

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)亦称老年性痴呆症，是引起痴呆的重要疾病来源，是一种以进行性认知功能障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。自1906年Alzheimer首次命名并报道该疾病以来，人们一直在寻找其发病机制及预防和治疗措施。虽然AD的病因复杂，但其具有三个特征性的病理改变,即形成以淀粉样蛋白(Aβ)沉积为核心的老年斑(SP)[1]，Tau蛋白过度磷酸化异常聚集形成的神经元内神经纤维缠结(NFTs)，神经元脱失。尽管发病机制目前还不十分明确，但Aβ作为AD发病的始动因子已基本得到认可。Aβ的过剩来源于两个途径:一是异常折叠的Aβ沉积，二是清除Aβ功能缺陷。本文就Aβ的形成及其致病机制研究进行综述。

1 Aβ的产生及其在AD发生中的作用

1984年,Glenner等[2]首次纯化Aβ。Aβ是由39-43个氨基酸组成的多肽，分子量约4.0-4.2KDa,是淀粉样前体蛋白(APP)通过一系列酶反应降解的一种可溶性产物。APP是一种跨膜糖蛋白，存在于多种细胞，由21号染色体中的一个基因编码，N端位于细胞外，C端位于细胞内。APP经两个途径降解,一是α分泌酶水解APP中687-688间即Aβ序列的16位赖氨酸和17位亮氨酸肽键，形成可溶性外功能区片段(sAPPα)释放到细胞外，同时将肽链碳端的83个氨基酸C83留在细胞膜上，γ分泌酶在712残基附近将其水解为p3和ACID，这一过程不能形成完整的Aβ片段;另一个途径是β分泌酶水解APP的671位蛋氨酸和672位天门冬氨酸之间的肽键(即Aβ序列的N端的第1位)，形成sAPPβ和β碳末端片段(CTFβ)，γ分泌酶在712-713之间作用，或在714之后作用(即Aβ的39-44之间的某个位点)，形成Aβ40或Aβ42和AICD。Aβ中90%为Aβ40，Aβ42的量少，但更容易聚集产生毒性。正常情况下，Aβ以溶解的状态存在，没有毒性，但当其形成β片层结构时容易聚集[3],形成寡聚体，积聚形成原纤维，沉积形成斑块，寡聚体已具有神经毒性[4]。Aβ被脑啡肽酶、胰岛素降解酶、血管紧张素转化酶降解。另有研究认为，APP降解产生的Aβ1-8、Aβ9-16、Aβ16、Aβ56(56kDa)也与AD 有关[5]。

Alzheimer报道该病后近80年的时间，对Aβ的研究有两种观点，一种认为细胞外Aβ沉积是AD的始动因子，另一种认为是继发性的。1990年后，众多研究表明,淀粉样蛋白沉积是AD发病的始动因子。(1)Wong等[1]发现，AD病人脑组织中的SP、NFT及中枢血管淀粉样病变(CVA)同样存在于成人唐氏综合征病人(aDs),唐氏综合征病人拥有一个额外的21染色体复制品。APP基因定位于21号染色体[6]，从AD、aDs这两种病人提取的淀粉样肽高度同源(N端28个氨基酸相同)，且超过40岁的aDs病人会发展为AD。CVA及SP中提取的淀粉样肽相同，且SP的严重程度与痴呆相关。(2)APP基因突变能导致家族性阿尔茨海默病(FAD)发生[7]，变异的APP可增加Aβ的生成和聚合，转人类FAD基因的小鼠可出现类似人类AD的症状[8]。在FAD中可见到与APP代谢相关的γ分泌酶催化亚基上早老素-1(PS-1)、早老素-2(PS-2)基因突变，突变后Aβ42生成增多，AD的发病几率增大[9]。(3)人群中载脂蛋白E(apoE)有三种基因型:apoE2、apoE3、apoE4，携带apoE4基因的人发生FAD的危险性增大[10]，因其能够易化Aβ的聚合和沉积。(4)Aβ代谢过程中相关蛋白质的基因突变会导致迟发性AD，如在迟发性FAD家族中发现第10号染色体上的降解Aβ的胰岛素降解酶的突变[11]。(5)Taguchi等[12]研究发现,外周给予AD病人血清中的IgM抗体,可以从Aβ的16-17、28-29位点水解Aβ40，治疗AD病人。(6)Pike等[13]研究发现，临床AD病人11C-PIBPET检查Aβ沉积与认知障碍有关，临床无症状的Aβ沉积病人的事件记忆能力减退，对有Aβ沉积的无症状个体进行干预是必要的。随着成像技术的发展，对AD病人脑成像、临床症状等相关性分析，认为Aβ沉积是AD的早期事件[14]。

2 Aβ引起AD的机制

目前，对Aβ引起AD的机制研究主要集中在氧化应激、炎症反应及神经元凋亡等方面。

2.1 Aβ与氧化应激 氧化应激指氧化系统的作用超越了抗氧化防御机制制约，机体产生过多的活性氧(ROS)，如果不能及时的清除和中和，则可与脂质、蛋白质、核酸发生反应，损伤细胞功能。有研究显示，Aβ本身可产生活性氧，也可通过多种途径诱导ROS产生[15],加重氧化应激。在转人类突变型APP/PS-1基因小鼠脑组织内，氧化应激明显升高[16]。活性氧的产生不仅损伤细胞功能，也可能影响到Aβ的清除。Nishida等[17]的VE转移蛋白基因敲除及AD转基因小鼠(Ttpa-/-APPsw)研究显示，VE的缺失使得脂质过氧化，进而减少了中枢注射Aβ40 的清除。另外，氧化应激与Aβ存在正反馈关系，氧化应激可以上调PS1及γ分泌酶活性，进而增加Aβ生成[18]。总之，Aβ寡聚体、纤维细丝、沉积可以诱导ROS产生，ROS损伤生物膜，影响细胞功能，减少对Aβ的清除，增加Aβ产生，Aβ增多进一步增加ROS产生，形成恶性循环。

氧化应激产生的ROS如何影响细胞功能，引起神经元损伤，脑能量代谢障碍与AD的发病有密切关系，线粒体作为能量代谢的主要场所，对维持神经元的功能有着重要意义。线粒体DNA(mtDNA)编码细胞色素氧化酶(COX)，且mtDNA位置靠近易产生氧自由基的线粒体内膜附近，极易受到自由基的攻击发生突变，Aβ本身产生或其它途径产生的活性氧使神经细胞胞浆中自由基浓度升高，从而使脂质过氧化,形成的过氧化产物损伤细胞膜结构，线粒体和内质网的膜结构氧化损伤后，将使大量的钙进入胞质，细胞发生钙超载[19]，线粒体肿胀，造成功能障碍，影响COX活性。由于COX是电子传递链的关键酶，其活性下降导致ATP水平下降，进一步使钙内流增加，损伤线粒体。线粒体功能下降还会使更多的APP被加工为有毒性的Aβ。另外，线粒体损伤，COX活性下降，可以导致细胞色素C(cyt-c)的释放，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)的活化，启动神经元凋亡。许多抗氧化植物药提取物通过抗氧化作用而减轻Aβ引起的损伤。

2.2 Aβ与免疫反应、炎症反应 小胶质细胞是定居在脑内的先天的免疫细胞(巨噬细胞)，内源性免疫缺陷会降低脑内Aβ的清除。异硫氰酸荧光素标记Aβ的实验研究发现，90%的正常人能有效的清除Aβ，AD 病人中只有15%能有效清除。正常人单核细胞能有效清除Aβ，而多数AD病人的巨噬细胞不能将Aβ转运至溶酶体，单核细胞不能有效的清除Aβ;经Aβ刺激后，正常人的单核细胞呈现出上调MGAT3 (β-1,4-mannosyl–glycoprotein-4-β-N-acetyl glucos aminyl transferase)和TLR(Toll-like receptor)基因的转录，这两种基因对吞噬细胞功能具有重要作用[20]，AD病人的单核细胞下调该基因。二去甲氧基姜黄素可以增强AD病人细胞的吞噬和清除Aβ的功能，增强MGAT3、TLR的转录。针对Aβ的疫苗免疫治疗，可减轻AD病人和动物模型的病理改变、行为改变及记忆力降低。

AD患者脑内促炎症因子升高，是由聚集在神经斑块内和邻近神经斑块激活的小胶质细胞释放的，小胶质细胞对Aβ及神经损伤产生应答，并且成为神经毒性细胞因子和活性氧的慢性来源。(1)小胶质细胞通过作用于和细胞表面受体结合的Aβ原纤维丝而激活细胞内信号转导级联反应，导致促炎症因子基因表达和促炎症因子TNF-α、IL-1β、PGE2、IFN-γ、活性氧，氮类产物形成如H2O2、O2-、ONOO-/ONOOH、NO，这些小胶质细胞炎症产物可以导致神经元死亡[21]。(2)大量证据表明，小胶质细胞对神经元损伤的反应是长久的，这种神经损伤引起的小胶质细胞激活称为活性胶质细胞。选择性iNOS抑制剂可保护神经元免于小胶质细胞、单核细胞分泌的产物的伤害。因此，Aβ通过小胶质细胞产生神经毒性，而神经损伤又可以作为刺激因子激活小胶质细胞产生神经损伤，形成恶性循环[22]。流行病学研究支持炎症在AD中的作用，非甾体抗炎药(NSAID)能降低AD发病率和严重程度[23]。NSAID是过氧化物酶增殖体激活受体(PPARγ)的配体，激动后抑制Aβ引起的小胶质细胞、单核细胞分泌促炎症因子引起的神经毒性、神经元死亡及星状胶质细胞激活，抑制单核细胞分化为活性的巨噬细胞，抑制Aβ引起的IL-6、TNF-α，抑制COX2,总之，抑制Aβ引起的小胶质细胞、单核细胞的炎症反应。小胶质细胞是AD病人脑内吞噬作用及炎症的标志物，AD病人和转基因小鼠脑内呈现出小胶质细胞炎症反应[24]。AD病人尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶表达上调，是胶质细胞介导Aβ毒性的一个重要成分，也是小胶质细胞外、细胞内产生活性氧的重要酶。小胶质细胞NADPH氧化酶活性的激活引起的神经毒性通过以下两个途径[25]:细胞外活性氧直接对神经元产生毒性，细胞内ROS则作为一个信号增强几个促炎症细胞因子和神经毒性因子的产生，如TNF-α、PGE2、IL-1β。

2.3 Aβ与神经元凋亡 细胞凋亡的途径，根据其启动与凋亡传导通路大致分为两类:死亡信号-受体途径(外源性)和线粒体途径(内源性)。Aβ主要通过后者引起神经元凋亡。从转突变APP基因小鼠皮层中纯化的线粒体基质内发现Aβ寡聚体[26]，Aβ在线粒体内的沉积在动物8-12月龄期间最快，最早发现沉积是在4个月，早于脑组织内Aβ在细胞外的沉积;对Tg mAPP小鼠Aβ42染色发现，40%的皮层、20%的海马神经元线粒体着色[27]。AD病人尸检免疫荧光双染也支持线粒体Aβ沉积与AD的关系[28]。线粒体包含三羧酸循环、氧化磷酸化等所需的重要酶，Aβ引起线粒体呼吸链的复合体Ⅲ(泛醌-细胞色素C-还原酶)、Ⅳ(细胞色素C氧化酶)活性降低[29]。线粒体内Aβ可以引起线粒体外膜通透性升高(MOMP)，Cyt-c释放，此释放为第一相释放。Cyt c的释放，可刺激内质网(内质网膜靠近线粒体膜)上IP3受体，促进钙无限制的释放，胞内钙的增多可刺激Cyt c的释放，引起凋亡[30]，此种凋亡不依赖caspase。COX作为电子传递链的关键酶，其活性的降低导致ATP产生下降，并且过多的电子直接使氧分子O2产生超氧阴离子O2-和其它 ROS。内膜上的心肌磷脂作为线粒体膜的唯一磷脂，也是ROS的靶点，ROS的升高引起心肌磷脂过氧化，氧化的心肌磷脂与Cyt-c结合力下降[31]，引起Cyt-c完全释放，此为第二相释放。在ATP、dATP存在下介导凋亡蛋白酶激活因子-1(Apaf-1)激活, 产生凋亡复合体, 刺激caspase-9激活，最终使caspase-3和其它caspase催化成熟，细胞凋亡。因此，线粒体引起的细胞凋亡有两种途径，依赖和不依赖caspase途径。一旦线粒体膜出现不可逆的通透性升高，细胞死亡不依赖于caspase活性。不依赖于caspase的细胞死亡，可能是因为线粒体重要功能的丧失和/或其它诱发凋亡的分子从线粒体内膜转移定位胞质，黄素蛋白凋亡诱导因子(AIF)、核酸内切酶G一旦进入胞质, 这两种蛋白能够转移定位到核内促进DNA 断裂，以caspase非依赖性引起细胞凋亡。

Aβ引起AD的机制很复杂，除以上探讨的机制外，胆碱能神经及其它神经递质学说、Tau蛋白学说、免疫反应等也与AD有关，但这些机制可能都与Aβ有关，或为起因，或为结果。各种机制间存在复杂的联系，贯穿其中的是ROS及线粒体。Aβ寡聚体、原纤维丝、线粒体基质沉积、细胞外沉积通过多种途径引起ROS产生，对膜产生损伤，ROS可以减少Aβ的清除，增加Aβ生成，形成恶性循环。ROS可以与脂质、蛋白质、核酸发生反应引起膜尤其是线粒体膜损伤，引起线粒体功能紊乱，导致细胞依赖和不依赖于caspase的凋亡，同时，线粒体功能紊乱引起ROS产生，造成恶性循环。Aβ刺激激活小胶质细胞分泌促炎症因子，引起细胞损伤，另外神经损伤再次激活小胶质细胞，小胶质细胞也可产生ROS引起损伤，形成恶性循环。总之，Aβ引起AD机制还不十分明确，但作为AD始动因子学说已得到广泛认可，针对Aβ产生、清除、引起AD机制的研究寻找了许多靶点，开发了很多药物，但由于AD作为一个自然衰老性疾病必然是一个多因素发病机制，任何单一的治疗可能都不会达到满意的效果，还需要大量的进一步研究其机制，寻找新的突破口。

[1]Wong CW,Quaranta V,Glenner GG.Neuritic plaques and cerebrovascular amyloid in Alzheimer disease are antigenically related[J].Proc Natl Acad Sci USA,1985,82(24):8729-8732.

[2]Glenner GG,Wong CW.Alzheimer’s disease:initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein[J]. Biochem Biophys Res Commun,1984,120(3):885-890.

[3]Tew DJ,Bottomley SP,Smith DP,et al.Stabilization of neurotoxic soluble beta-sheet-rich conformations of the Alzheimer’s disease amyloid-beta peptide[J].Biophys J,2008,94(7): 2752 -2766.

[4]Deshpande A,Mina E,Glabe C,et al.Different conformations of amyloid beta induce neurotoxicity by distinct mechniasms in human cortical neurons[J].Neuroscience,2006,26(22):6011-6018.

[5]Chiang PK,Lam MA,Luo Y.The many faces of amyloid beta in Alzheimer’s disease[J].Curr Mol Med, 2008,8(6):580-584.

[6]Mann DM.Cerebral amyloidosis, aging and Alzheimer’s disease; a contribution from studies on Down’s syndrome[J].Neurobiol Aging,1989,10(5):397-399.

[7]Goate A.Segregation of a missense mutation in the amyloid beta-protein precursor gene with familial Alzheimer’s disease[J].J Alzheimers Dis,2006,9(3 Suppl):341-347.

[8]Games D, Adams D, Alessandrini R, et al. Alzheimer-type neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F betaamyloid precursor protein[J].Nature,1995,373(6514):523-527.

[9]Small DH,Klaver DW, Foa L.Presenilins and the gammasecretase: still a complex problem[J]. Mol Brain,2010,3(1):7.

[10]Corder EH,Saunders AM,Strittmatter WJ,et al.Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer’s disease in late onset families[J].Science,1993,261(5123):921-923.

[11]Yao J, Petanceska SS, Montine TJ, et al. Aging, gender and APOE isotype modulate metabolism of Alzheimer’s Abeta peptides and F-isoprostanes in the absence of detectable amyloid deposits[J].J Neurochem,2004,90(4):1011-018.

[12]Taguchi H, Planque S, Nishiyama Y, et al.Autoantibody catalyzed hydrolysis of amyloid beta peptide[J].J Biol Chem,2008,283(8):4714-4722.

[13]Pike KE,Savage G,Villemagne VL,et al.Beta-amyloid imaging and memory in non-demented individuals: evidence for preclinical Alzheimer’s disease[J].Brain,2007,130(11):2837-2844.

[14]Rabinovici GD,Jaqust WJ.Amyloid imaging in aging and dementia:testing the amyloid hypothesis in vivo[J].Behav Neurol,2009,21(1):117-128.

[15]Ge YS, Teng WY , Zhang CD. Protective effect of cyclophilin A against Alzheimer′s amyloid beta-peptide (25-35)-induced oxidative stress in PC12 cells[J].Chin Med J(Engl),2009,122(6):716-724.

[16]Abdul HM,Sultana R,St Clair DK,et al.Oxidative damage in brain from human mutant APP/PS-1 double knock-in mice as a function of age[J].Free Radic Biol Med,2008,45(10):1420-425.

[17]Nishida Y, Ito S, Ohtsuki S, et al. Depletion of vitamin E increases Abeta accumulation by decreasing its clearances from brain and blood in a mouse model of Alzheimer disease[J]. J Biol Chem,2009,284(48):33400-33408.

[18]Tamagno E, Guglielmotto M, Aragno M, et al. Oxidative stress activates a positive feedback between the γ-and β-secretase cleavages of the β-amyloid precursor protein[J].J Neurochem,2008,104(3):683-695.

[19]Alberdi E,Sánchez-Gómez MV,Cavaliere F,et al.Amyloid beta oligomers induce Ca2+dysregulation and neuronal death through activation of ionotropic glutamate receptors[J].Cell Calcium,2010,47(3):264-272.

[20]Fiala M,Liu PT,Espinosa-Jeffrey A,et al.Innate immunity and transcription of MGAT-III and Toll-like receptors in Alzheimer’s disease patients are improved by bisdemethoxycurcumin[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(31):12849-2854.

[21]Block ML,Zecca L,Hong JS.Microglia-mediated neurotoxicity:uncovering the molecular mechanisms[J].Nat Rev Neurosci,2007,8(1):57-59.

[22]García-Matas S,de Vera N,Aznar AO,et al.In vitro and in vivo activation of astrocytes by amyloid-beta is potentiated by prooxidant agents[J].J Alzheimers Dis,2010,20(1):229-245.

[23]Choi JK, Jenkins BG,Carreras I, et al.Anti-inflammatory treatment in AD mice protects against neuronal pathology[J].Exp Neurol,2010,223(2):377-384.

[24]Simard AR,Soulet D,Gowing G,et al.Bone marrow-derived microglia play a critical role in restricting senile plaque formation in Alzheimer’s disease[J].Neuron,2006,49(4):489-502.

[25]Qin B,Cartier L,Dubois-Dauphin M,et al.A key role for the microglial NADPH oxidase in APP-dependent killing of neurons[J].Aging,2006,27(11):1577-587.

[26]Nishitsuji K,Tomiyama T,Ishibashi K,et al.The E693Δ mutation in amyloid precursor protein increases intracellular accumulation of amyloid β oligomers and causes endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in cultured cells[J].Am J Pathol,2009,174(3):957-969.

[27]Manczak M, Anekonda TS, Henson E, et al.Mitochondria are a direct site of A beta accumulation in Alzheimer’s disease neurons:implications for free radical generation and oxidative damage in disease progression[J].Hum Mol Genet,2006,15(9):1437-449.

[28]Caspersen C,Wang N,Yao J,et al.Mitochondrial Abeta: a potential focal point for neuronal metabolic dysfunction in Alzheimer’s disease[J].FASEB J,2005,19(14):2040-2041.

[29]Boehning D,Patterson RL,Sedaghat L,et al.Cytochrome c binds to inositol(1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calciumdependent apoptosis[J].Nat Cell Biol,2003,5(12):1051-061.

[30]Kagan VE, Borisenko GG, Tyurina YY, et al. Oxidative lipidomics of apoptosis: redox catalytic interactions of cytochrome c with cardiolipin and phosphatidylserine[J].Free Radic Biol Med, 2004,37(12): 1963-1985.

[31]Otera H, Ohsakaya S, Nagaura Z, et al. Export of mitochondrial AIF in response to proapoptotic stimuli depends on processing at the intermembrane space[J].EMBO J,2005,24(7):1375-386.

R592

A

1004-6879(2012)03-0306-04

2012-03-14)

△ 通讯作者