rhG-CSF动员后联合骨髓干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变的临床观察

周亚茹，李春芝，栾 峰，孟建波，胡晓东，王战建*

（1.河北医科大学第三医院内分泌科，河北石家庄 050051；2.河北医科大学第三医院耳鼻喉科，河北石家庄 050051；3.河北医科大学第三医院血液科，河北石家庄 050051；4.河北省健海生物芯片技术有限责任公司，河北石家庄050035）

rhG-CSF动员后联合骨髓干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变的临床观察

周亚茹1，李春芝1，栾 峰2，孟建波3，胡晓东4，王战建1*

（1.河北医科大学第三医院内分泌科，河北石家庄 050051；2.河北医科大学第三医院耳鼻喉科，河北石家庄 050051；3.河北医科大学第三医院血液科，河北石家庄 050051；4.河北省健海生物芯片技术有限责任公司，河北石家庄050035）

目的探讨重组人粒细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhGCSF）动员后联合骨髓干细胞移植治疗糖尿病下肢血管病变的有效性和安全性。方法选择30例糖尿病下肢血管病变患者，采用rhG-CSF动员后联合骨髓干细胞对患肢进行治疗，以治疗前作为自身对照；治疗后1～6个月观察患者肢体肤色、皮温、肢体麻木疼痛、间歇性跛行、踝肱指数（ankle brachial index，ABI）及经皮氧分压（transcutaneous pressure of oxygen，TcPO2）的变化。结果治疗后患者肢体皮肤颜色、皮温、肢体麻木疼痛症状、间歇性跛行及ABI、TcPO2均较治疗前明显改善，且无相关并发症和不良反应发生。结论rhG-CSF动员后联合骨髓干细胞移植可有效治疗糖尿病下肢血管病变，此治疗方法安全、有效，能提高患者的生活质量。

糖尿病；干细胞移植；粒细胞集落刺激因子

KEY WORDS：diabetic mellitus；stem cells transplantation；granulocyte clony-stimulating factor

近年来糖尿病患病率呈明显上升趋势，中国已成为全球糖尿病患病例数最多的国家。糖尿病的最大危害是其慢性并发症，可累及全身多个器官系统，其中下肢血管病变（lower limb vascular disease，LVD）是最严重的并发症之一，典型症状包括间歇性跛行、静息痛、皮肤溃疡和坏疽，是糖尿病患者致残、致死的主要原因。LVD患者常有动脉远端血管闭塞或狭窄，血液循环差，内科常规的抗凝、调脂、扩血管等药物治疗效果不明显。此外，LVD属多节段血管病变，多数患者无法进行介入治疗或血管搭桥手术。因此，通过干细胞移植等手段，提高血管再生能力，促进侧支循环的形成，成为治疗LVD的新手段。本研究旨在探讨rhG-CSF动员后联合骨髓干细胞移植治疗糖尿病LVD的有效性和安全性。

1 资料与方法

1.1 研究对象：2009年1月—2010年12月在河北医科大学第三医院内分泌科和石家庄市肾病医院干细胞研究中心就诊的糖尿病伴有LVD患者30例［有足部和（或）下肢发凉、麻木、疼痛，间歇性跛行，足部溃疡等症状］。均排除糖尿病视网膜出血性病变，严重心、肝、肾、肺功能不全或一般状况很差不能耐受干细胞移植术者。其中男性20例，女性10例，年龄35～72岁，平均（55±8）岁，病程4～27年，平均病程（11±3）年。均有肢体冷感、疼痛症状，25例患者有肢体麻木症状，14例患者有足部溃疡。所有患者均签署知情同意书并经医学伦理委员会论证通过。

1.2 方法：采用治疗前后自身对照研究，评价指标及标准如下。①足部溃疡的分级（Wagner分级法），0级，有发生足溃疡的危险因素，目前皮肤无开放性病灶；1级，表面有溃疡，临床上无感染；2级，较深的溃疡感染病灶，常合并软组织炎，无脓肿或骨的感染；3级，深度感染，伴有骨组织病变或脓肿；4级，骨质缺损，部分趾、足坏疽；5级，足的大部或全部坏疽。②踝肱指数（ankle-brachial index，ABI），采用彩色双功能超声诊断仪测定ABI，正常值0.9～1.3，ABI＜0.9表示下肢血管存在不同程度的狭窄（缺血），ABI＞1.3表示动脉硬化。③经皮氧分压（transcutaneous oxygen pressure，TcPO2），采用经皮氧分压检测仪测定足背TcPO2，TcPO2测定能较好地反映足踝以下部位皮肤的微循环状态，从而反映周围动脉灌注情况。

1.3 治疗过程：①干细胞治疗前，使患者空腹血糖

控制在 8mmol/L以下，餐后 2h血糖控制在10mmol/L以内。②重组人粒细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony stimulating factor，rhG-CSF）动员后联合自体骨髓干细胞移植，术前 1～4d皮下注射粒细胞集落刺激因子300μg/d，第5天在硬膜外麻醉下取患者髂骨骨髓血300mL，经沉淀、离心、分离后制备40mL骨髓干细胞悬浊液，计数细胞总量及CD34+细胞含量。在硬膜外麻醉下，沿腓肠肌局部缺血部位多点肌内注射骨髓干细胞悬浊液［0.1mL（5×106个骨髓单个核细胞）/点］，各点间距2cm×2cm。③其他治疗，在干细胞移植治疗的同时给予降糖、调脂、降压、扩血管以及足部溃疡定期清创换药治疗。

1.4 统计学方法：应用SPSS13.0统计软件进行数据分析。计量资料以±s表示，组内治疗前后比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 主观评价指标：干细胞移植术后1个月患肢疼痛的改善率达90%（27/30），患肢冷感的改善率为100%（30/30），肢体麻木改善率达92%（23/ 25），足部溃疡的好转率为71.4%（10/14）。其中肢体冷凉的症状缓解最快，在术后3～4d即有缓解；肢体麻木及疼痛感在术后1周开始缓解，1个月后达到稳定状态。6例1级足部溃疡完全愈合，3例2级溃疡中2例转为1级，5例4级溃疡中2例溃疡范围缩小，3例症状无缓解（糖尿病病史较长，血糖控制较差，有多年吸烟史）。

2.2 客观评价指标：①间歇性跛行，30例患者中有18例存在间歇性跛行，经干细胞移植治疗后，其中10例患者正常步速下行走500m以上无肢体疼痛症状出现，3例患者步行距离较术前增加100m以上，但未达到500m，总有效率为72.2%。②ABI，干细胞移植后6个月，患者下肢ABI由术前的0.45± 0.11增加到术后的0.69±0.13，差异有统计学意义（t=7.719，P＜0.01）。③TcPO2，干细胞移植术后6个月，与治疗前相比，患者足背 TcPO2由术前的（18±2）mmHg增加到术后的（25±2）mmHg，差异有统计学意义（t=13.555，P＜0.01）。

2.3 相关并发症和不良反应：干细胞移植过程中，患者无不适症状。移植术后24h可见受试肢体轻度肿胀，患者有胀感，1周后肿胀消失。整个治疗过程中，患者均未出现异常症状及体征，其血细胞分析、凝血酶原时间和肝、肾功能无特殊改变。

3 讨 论

目前，内科手段治疗糖尿病下肢血管病变疗效有限。干细胞是一类具有自我复制和更新能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，可用于治疗如血液病、下肢缺血性疾病［1-2］等多种病变。自体干细胞植入缺血的肢体，可促进局部血管的形成，取得明显疗效，国内外已有不少报道［3-4］。本课题组前期动物实验研究结果显示，rhG-CSF动员后联合骨髓干细胞局部注射移植可治疗糖尿病下肢缺血性疾病，其效果明显优于单纯用rhG-CSF治疗和单纯骨髓干细胞移植治疗。此方法疗效好可能归于以下几点：①骨髓中存在许多种类的成体干细胞，对于外周血源的单个核细胞来说，骨髓源的单个核细胞群中含有更多的有利于血管新生的细胞亚群。②经动员刺激的骨髓内存在大量更原始的干细胞和（或）血管内皮祖细胞，这些细胞的分化能力更强，更利于细胞的融合和血管的新生。③经动员刺激可使附壁的骨髓间充质细胞的贴壁能力下降，经过带侧孔的骨髓穿刺针的用力抽吸，可使更多的骨髓间充质细胞被抽出，同时也可得到一部分细胞生长因子，有利于创造一个细胞生长所需要的基质环境［5］。④局部注射可使干细胞直接到达患处，避免了经外周血注射带来的对干细胞高血糖毒性和归巢效率不高的弊端。基于此研究基础，我们进一步探讨了rhG-CSF动员后联合骨髓干细胞移植治疗糖尿病LVD患者的有效性和安全性，我们将分离纯化的干细胞在下肢缺血部位多点肌内注射，无需特殊麻醉，结果显示患者术中无特殊不适，与以往的研究相一致［6］。

已有研究［7］证实在治疗过程中应先将坏疽及溃疡清疮，切口较为新鲜后再行干细胞移植可加速痊愈，如已出现坏疽，截肢将不可避免。因此，患者在疾病早期进行干细胞移植对于保留肢体是非常有意义的。我们共治疗了30例糖尿病伴LVD的患者，结果显示，治疗后患者肢体皮肤颜色、皮温、肢体麻木和（或）疼痛症状、间歇性跛行、ABI及TcPO2均较治疗前明显改善。治疗疗效欠佳的均为病程长（＞20年）的老年糖尿病患者，上述患者平时血糖控制不佳，均有20年以上的吸烟史，血管条件相对较差。本课题组前期动物实验研究结果显示高血糖是影响骨髓干细胞移植促血管新生效果的重要因素。因此，采用干细胞治疗糖尿病下肢血管病变，宜选择病变早期并且血糖控制好的病例进行，可得到满意疗效。

下肢皮肤微循环功能障碍导致皮肤供氧减少是糖尿病LVD的重要危险因素，在微循环的检查应用于糖尿病下肢缺血性疾病的筛查研究中，TcPO2的检测日益引起人们的注意［8］。有研究对TcPO2在评价微循环障碍的准确性上与ABI检测做了对比，结果符合率为93.9%，敏感度90.2%，特异度约95.2%［9］。现在普遍认为 20mmHg≤TcPO2＜40mmHg为动脉灌注轻度受损，其中TcPO2＞30mmHg切口愈合可能性大。可见，TcPO2的测定可作为诊断下肢动脉硬化闭塞、早期发现糖尿病足溃疡的风险指标。本研究结果显示，干细胞移植术后6个月，与治疗前相比，患者足背TcPO2由术前的（18±2）mmHg增加到术后的（25±2）mmHg，差异有统计学意义（P＜0.01）。

综上所述，rhG-CSF动员后联合骨髓干细胞局部注射移植治疗，可有效缓解患者肢体皮肤颜色、皮温、肢体麻木疼痛症状，患者间歇性跛行及 ABI、TcPO2均较治疗前明显改善。因此，rhG-CSF动员后联合骨髓干细胞移植可有效治疗糖尿病LVD，此治疗方法安全、有效，能提高患者的生活质量。

［1］HAMANO K，LI TS，KOBAYASHI T，et al.The induction of angiogenesis by the implantation of autologous bone marrow cell：a novel and simple therapeutic method［J］.Surgery，2001，130（1）：44-54.

［2］HASEBE H，OSADA M，KODAMA Y，etal.Therapeutic angiogenesis by autologous transplantation of bone-marrow cells in a patient with progressive limb ischemia due to arteriosclerosis obliterans：a case report［J］.J Cardiol，2004，43（4）：179-183.

［3］TATEISHI-YUYAM AE，MATSUBARA H，MUROHARA T，et al.Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-m arrow cells：a pilot study and a cont rolled trial［J］.Lancet，2002，360（9331）：427-435.

［4］杨晓凤，吴雁翔，王红梅，等.自体外周血干细胞移植治疗62例缺血性下肢血管病的临床研究［J］.中华内科杂志，2005，44（2）：95-98.

［5］谷涌泉，张健，齐立行，等.骨髓动员刺激后自体骨髓源单个核细胞移植治疗下肢缺血的初步临床研究［J］.中国修复重建外科杂志，2006，20（10）：1017-1020.

［6］张瑞清，郑宪玲，崔凤琴，等.自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足16例疗效观察［J］.临床荟萃，2009，24（16）：1432-1433.

［7］王广宇，朱旅云，马利成，等.自体干细胞移植治疗重症糖尿病足15例［J］.临床荟萃，2008，23（1）：45-46.

［8］PROCHAzKA V，GUMULEC J，CHMELOV ÁJ，et al.Autologous bone marrow stem cell transplantation in patients with end-stage chronical critical limb ischemia and diabetic foot［J］.Vnitr Lek，2009，55（3）：173-178

［9］李梦娟，李素梅，汝燕，等.经皮氧分压联合踝臂指数在2型糖尿病合并下肢动脉病变中的临床应用［J］.国际病理科学与临床杂志，2011，31（5）：381-384.

（本文编辑：刘斯静）

BONE MARROW STEM CELL TRANSPLANTATION COMBINED WITH rhG-CSF IN TREATING DIABETIC LOWER LIMB VASCULAR DISEASE

zHOU Yaru1，LI Chunzhi1，LUAN Feng2，MENG Jianbo3，HU Xiaodong4，WANG zhanjian1*
（1Department of Endocrinology，the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China；2.Department of Ophthalmology and otorhinolaryngology，the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China；3.Department of Hematology，the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China；4.Gene-Health Biochip Techology Company Limited，Hebei Province，Shijiazhuang 050035，China）

ObjectiveTo evaluate the effect and safety of bone marrow stem cell transplantation combined with hypodermic injection of recombinant human granulocyte-colony stimulating factor（rhGCSF）in treating diabetic lower limb ischemia.MethodsThirty patients with diabetic lower limb ischemia diseases were enrolled in this study.The patients received rhG-CSF and bone marrow stem cell transplantation by intramuscular injections at multiple sites of affected limb.During 1～6 months of follow-up，skin color，skin temperature，sensation，claudication，ankle brachial index（ABI），and transcutaneous pressure of oxygen（TcPO2）were observed and compared with pre-treatment.ResultsThe symptoms were greatly relieved 1 month after treatment.The ABI and TcPO2 were increased from 0.45±0.11 to 0.69±0.13 and 18±2 to 25±2（P＜0.01）6 months after stem cell transplantation treatment，respectively.ConclusionrhG-CSF combined with bone marrow stem cell transplantation is an effective and feasible method for the treatment of diabetic lower limb ischemia disease.

R587.1

A

1007-3205（2012）11-1245-03

2012-04-24；

2012-06-17

河北省科技厅重大疾病及创新药物专项基金资助项目（06276106D）

周亚茹（1972-），女，河北唐山人，河北医科大学第三医院副主任医师，医学博士，从事内分泌疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail：hbsywzj@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.11.002