实时荧光PCR方法在食品真伪辨别中的应用

李富威，高 琴，张舒亚，*，谌鸿超，包建强，郭云霞

（1.上海出入境检验检疫局，上海 200135;2.上海海洋大学食品学院，上海 201306)

实时荧光PCR方法在食品真伪辨别中的应用

李富威1，2，高 琴1，张舒亚1，*，谌鸿超1，包建强2，郭云霞2

（1.上海出入境检验检疫局，上海 200135;2.上海海洋大学食品学院，上海 201306)

实时荧光PCR技术以其特异性、灵敏性、简便、快速的优点，广泛应用于食品鉴伪检测。本文阐述了实时荧光PCR的原理以及其在肉制品、高价值食品、乳制品、果汁、水产品和油脂鉴伪检测方面的应用情况。

食品，真伪鉴别，实时荧光PCR

食品加工技术的不断发展为人们提供越来越多的品种、口味和形态各异的食品。随着中国经济的全面发展，人们的消费观念不断发生变化，对食品的要求不仅是结构的多样性，而且日益注重食品的质量。近年来，在国内外市场上出现了许多掺假、掺杂、伪造食品。食品掺假指食品中非法掺入外观、物理性状或形态相似的非同种类物质，如蜂蜜中加入转化糖，藕粉中混入薯粉;食品掺杂指在食品中非法掺入一些杂物，比如一些非同一种类或同种类劣质物质，粮食中掺入沙石，牛肉中掺入马肉等;食品伪造指包装标识或产品说明与内装食品的种类、品质、营养成分名不副实的假冒做法，如假燕窝、假鱼翅、假乳粉、假人参、假鹿茸等[1]。这些不法行为不仅直接损害了消费者的经济利益，而且极有可能因为某些过敏原或有害成分的引入，危害消费者健康，因此加强打假的力度刻不容缓，这就需要不断提高食品检测技术，来鉴别掺杂、造假的食品。近年来，随着生物新技术发展，食品鉴别的技术发展也突飞猛进，有关PCR技术鉴别食品真伪的研究呈增长趋势。实时荧光PCR以其高特异性、灵敏性、可定量、无污染等优点，得到了广泛的关注，越来越多的被用于食品的检测。本文主要对近年来有关实时荧光PCR在食品真伪辨别中应用的研究报道进行综述。

1 实时荧光PCR方法原理

所谓的实时荧光PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测[1]，实现对起始模板定性及定量的分析。在实时荧光PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图[2]。

实时荧光PCR类型主要有特异性荧光探针类和嵌入荧光染料类两种。特异性荧光探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物增加，如TaqMan探针、Light Cycler双探针;嵌入荧光染料类是利用染料与双链DNA小沟结合发光来指示扩增产物的增加，常用的有SYBR、Eva green染料等。

2 实时荧光PCR方法优缺点

实时荧光PCR方法自动化程度高、灵敏度高，同时通过光学系统检测荧光信号而省去了凝胶电泳的繁琐操作，减少了假阳性的发生率，避免了实验过程中染色剂溴化乙锭对人体的潜在危害。另外，实时荧光PCR也有其不足之处：荧光染料类实时荧光PCR由于荧光染料可以和任何双链DNA结合，因此DNA引物二聚体或其他非特异扩增产物会对定量结果产生干扰，降低了反应的专一性和可重复性。

3 实时荧光PCR在食品真伪辨别中的应用

3.1 肉类及其制品鉴伪

肉类是百姓生活的必需品。目前，国内市场上在肉和肉制品的生产与销售中，利用掺杂造假、以次充好等手段欺骗消费者。掺杂造假的手段包括混入，假冒，以病死畜禽肉充当好肉，以不新鲜肉充当新鲜肉，以低价肉充当高价肉，肉注水，粉饰，香肠中食用过量淀粉等[3]。其中，尤以掺杂异种肉等造假行为较为常见。这不仅仅涉及经济、营养价值和食品安全等问题，更直接影响着消费者的健康。因此，对食品中原料肉进行物种鉴定显得十分必要，要检测出肉制品中肉的组成比较困难，PCR方法由于其反应时间短，具有较高灵敏性、特异性和可鉴别性，成为物种鉴别中最常用的方法[4-5]。而新兴的实时荧光定量PCR技术可以精确地对DNA进行定性定量分析。

张宏伟等用PCR和实时荧光PCR方法检测食物中猪成分，依据猪线粒体DNA中的细胞色素b基因序列设计一对特异性引物，用于检测食物中的猪源成分[6]。Jason Sawyer等采用通用引物，物种特异引物和实时荧光定量PCR技术分析出在牛羊混合物中牛肉的掺入量;首先测定出一系列已知牛肉含量的标准曲线，再对未知样品进行荧光PCR扩增，将结果与标准曲线进行对比，检测出2%的牛肉掺入量[7]。Chun-Lai Zhang根据牛线粒体的cytb基因序列设计了一对特异性引物及探针，建立了实时PCR检测方法，可检出35pg DNA的牛样品，和绵羊、山羊、猪样品无交叉反应，运用此方法有效的从新鲜肉及加工肉检测到牛的DNA[8]。Miguel A.Rodríguez通过实时PCR扩增12S rRNA基因，扩增长度425～428bp，有效地分析出混合肉中猪肉的掺入量[9]。Fajardo V用实时PCR方法检测混合肉中鹿成分[10]。KÊppel R等建立了实时定量PCR检测食物中的猪肉、鸡肉、羊肉、马肉成分[11]。J.Chisholm等报道了用实时PCR方法检测肉中马肉和驴肉成分[12]。John JDooley等进行了实时荧光PCR鉴别牛肉、猪肉、羊肉、鸡肉和火鸡肉的研究[13]。

3.2 高价值食品鉴伪

随着生活水平的提高，人们对高营养价值和高经济价值的保健产品需求日益增长，供不应求，因此市场上假冒伪劣产品很多，如假冬虫夏草、假人参、假燕窝、假鹿茸等。高价值品的鉴伪方法较多，早期的鉴别研究多采用性状鉴别、显微鉴别及简单的理化鉴别，但存在鉴别结果可靠性不高等问题，实时荧光PCR方法应用于高价值食品的真伪鉴别，准确性高、实用性强。

Yajun Wu等运用SYBR GreenⅠ荧光 PCR快速检测燕窝制品中燕窝成分，可检测到0.5%的燕窝和银耳混合物[14]。陈颖等建立了实时荧光PCR鉴别鱼翅的方法，能够简单、快速、特异且灵敏地鉴别鱼翅的真伪[15]。马骏等公开了运用实时荧光PCR鉴别及检测冬虫夏草的方法，除了能定性鉴别冬虫夏草的真伪外，还能检测样品中冬虫夏草的含量，其检测限量可低至0.0001ng/μL，比现有技术更加灵敏[16]。陈颖等建立了马鹿茸、梅花鹿茸真伪鉴别的实时荧光PCR检测方法[17-18]。徐君怡等针对虎线粒体细胞色素b（cytb)基因设计特异性引物，建立并优化SYBR GreenⅠ荧光PCR检测鉴定体系，检测灵敏度可达到在骨粉中检出质量分数为0.05%的虎源性成分，SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复性好等特性，可用于虎制品的检测鉴定[19]。徐君怡等建立SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测鉴定狮制品的方法，检测出10pg/μL的狮组分DNA，抗干扰能力显示在骨粉中狮的成分最低检出含量为0.1%[20]。

3.3 乳及乳制品鉴伪

牛奶因其良好的营养功效备受国内外消费者的青睐，然而伴随着乳品加工行业的迅猛发展，在巨大经济利益的驱使下，乳品的掺假现象越来越严重。掺伪方式有掺水增加奶液体积，掺入物理、化学性质相近物质及液体，以次充好[3]。就世界范围的牛奶掺假检测而言，传统的化学分析方法在现阶段仍占主导地位，现在的食品掺伪水平和手段越来越高明，使一些检测鉴别掺伪的传统方法已越来越不能满足日益发展的社会需求[21-22]。随着分子生物学技术的不断发展，以DNA为基础的检测方法和手段越来越多的应用于食品检测中。加工食品原材料成分复杂，且大部分加工食品都经过了高温加热的过程，导致蛋白质变性，生物酶失活，无法作为检测指标，而PCR检测的检测对象是脱氧核酸（DNA)，在深加工食品中仍有核酸的存在，因此，PCR检测法不受材料的限制，可以应用于深加工食品的检测。

岳巧云等建立了利用实时荧光PCR方法，以大豆内源参照基因lectin为指标，对奶粉中掺入豆粉等植物成分进行定性、定量分析的方法[23]。Chun-Lai Zhang等建立了牛奶及奶酪中牛成分的实时PCR检测方法[8]。López-Calleja等依据12S rRNA基因序列设计了实时PCR引物，从牛奶和羊奶的混合物中有效地检出牛奶成分，特异性和灵敏度高[24]。López-Calleja等建立了实时PCR在绵羊奶混合物中成功检出山羊奶[25]。Alba N Mininni等用实时荧光PCR检出绵羊和山羊奶中的牛奶成分[26]。

3.4 果汁及饮料鉴伪

近年来，果汁消费量的速度急剧增加，由于果汁是以水果为原料生产的，其产量受多种因素的影响，往往价格较高。受经济利益的驱使，一些不法生产者往往采用各种手段向市场提供各种掺假果汁。按照果汁的定义，除以浓缩果汁为原料生产还原果汁时可添加与果汁浓缩时失去的天然水分等量的水外，果汁类产品是不允许添加任何外来物质的。因此，任何添加了外来物质的果汁，都认为是掺假果汁。果汁和果汁饮料的掺假严重损害了消费者的利益，应重视掺伪果汁检测技术的研究。果汁鉴伪一直基于感官、理化等方法进行检测分析，现代生物技术的发展和应用，给果汁鉴伪研究注入新的血液，具有方便、准确、迅速、简洁的特点，能够准确无误地从基因水平分析果汁的品种和来源，其结果为证明果汁的真伪提供了可靠的依据[27-28]。目前，很多研究机构将PCR技术应用于果汁的掺伪鉴别和质量控制中。

Morton等用PCR技术鉴别苹果品种，为利用PCR技术进行苹果汁的鉴伪奠定研究基础[29]。韩建勋等建立了梨成分的实时荧光PCR检测方法，该方法能够有效检测到果汁中的梨成分，具有特异性强，灵敏度高等优点，可应用于果汁或食品中梨成分的鉴别[30]。Palmieri L.等报道根据5S rRNA基因序列和ANS（anthocyanidin synthase)序列设计特异性引物，用实时荧光PCR方法检测食品中的桔子、菠萝、蓝莓、草莓成分[31]。

3.5 水产品鉴伪

近年来对水产品的消费逐渐上升，一些不法商贩在水产品加工中掺假造假，以低价水产品代替高价水产品出售，一方面大大损害了消费者的利益，另一方面也造成了不正当的商业竞争。在水产品加工中，物种的原始可识别形态特征消失，这使得物种的鉴别变得相对困难。研究人员开始用实时荧光PCR方法对水产品进行物种鉴定，这为判定水产品掺杂造假提供了技术支持。

Beatriz Herrero等运用TaqMan实时荧光PCR方法检测和鉴定大西洋鲑，实验结果显示大西洋鲑的Ct值为12±2其他物种样品Ct值大于27，该方法可用于新鲜，冷冻，加工过的鱼产品的检测[32]。A.Sa′nchez等进行了TaqMan实时荧光PCR鉴定欧洲无须鳕的研究，结果表明此方法快速准确[33]。Beatriz Herrero等用TaqMan实时荧光PCR检测和识别大西洋鳕鱼，该方法可以应用于各类产品，新鲜、冷藏、加工的产品，包括那些经深加工的产品[34]。鶴田小百合等根据cytb基因设计了特异性引物，建立了TaqMan实时荧光PCR检测和鉴定太平洋鳕，阿拉斯加狭鳕，毛鳞鱼的方法[35]。Martin I.Taylor等建立了TaqMan实时荧光PCR同时鉴定大西洋鳕，黑线鳕和牙鳕的方法[36]。Itziar Lopez等用TaqMan实时荧光PCR方法对黄鳍金枪鱼和长鳍金枪鱼进行定性和定量的研究[37]。

3.6 油脂鉴伪

目前我国食用油脂掺假现象仍很常见，严重影响人民身体健康，是油脂食品安全问题重中之重。食用油脂的掺伪现象主要表现为未精炼的机榨及变质油，不同油脂勾兑，在食用油中掺入非食用油脂，用煎炸餐饮残油替代食用油脂，地沟油回收使用，动物油脂的非法回收使用等[3]。食用油掺假掺杂不仅威胁着人们的身体健康，而且侵犯消费者利益，影响消费信心，不利于食用油产业的健康发展。运用分子生物学技术对食用油进行品种鉴定及掺假检测是新发展起来的一种检测方法，与传统方法的理化检测和仪器分析检测相比（如测定过氧化值、脂肪酸比例，色谱分析等)，具有检测灵敏度高，可靠性强，操作简单和省时省力等优点[38-39]。

覃文等采用实时荧光PCR技术，通过检测花生的种属特异性基因片段，定性检测市售食用混合油脂中的花生油成分，并对其中花生油的含量检测进行了探索研究。结果表明，食用油脂中可提取出用于定性定量PCR的DNA，花生的Arah1基因是具有花生种属特异性的基因，采用实时荧光PCR方法检测Arah1基因片段可定性定量检测混合食用油脂中的花生油成分，为定性定量检测混合食用油中其他组分提供了技术平台[40]。栾凤侠等用实时荧光PCR技术成功地检测出了食用油脂中的内源基因和外源基因[41]。然而，由于油脂的DNA极易破坏和断裂，所以对于精炼油的PCR检测较难。

4 结论

近年来，市场上食品掺伪造假的现象十分严重，为了保护消费者利益和维护市场秩序，食品掺伪检测的重要性显而易见。现在的食品掺伪水平和手段越来越高明，仿真度极高的劣质产品给检验工作带来了巨大的挑战，使许多检测鉴别掺伪的传统方法已无法测定。实时荧光PCR技术从基因水平分析食品原料和产品的特性，为证明食品的真伪提供了可靠的依据。该技术以其高准确度、高精确度的优点将取得更快更好的发展。本领域应致力于解决当前实时荧光PCR技术中存在的一些问题，推动该技术在食品检测及其他领域的应用和普及。

[1]陈颖，董文，吴亚君，等.食品鉴伪技术体系的研究与应用[J].食品工业科技，2008，29（7)：216-218，312.

[2]朱捷，杨成君，王军.荧光定量PCR技术及其在科研中的应用[J].生物技术通报，2009（2)：73-76.

[3]陈敏，王世平.食品掺伪检验技术[M].北京：化学工业出版社，2007.

[4]高琳，徐幸莲，周光宏.PCR技术用于食品中原料肉物种鉴别的研究进展[J].肉类研究，2006（10)：19-21，33.

[5]陈颖，葛毅强.现代食品分子检测鉴别技术[M].北京：中国轻工业出版社，2008.

[6]张宏伟，赵良娟，赵宏，等.高效快速检测食物中猪成分的PCR和RT-PCR方法[J].食品研究与开发，2009（6)：120-123.

[7]Jason Sawyer，Clare Wood，Della Shanahan，et al.Real-time PCR for quantitative meat species testing[J].Food Control，2003，14（8)：579-583.

[8]Zhang CL，FowlerMR，Scott NW，et al.A TaqMan real-time PCR system for the identification and quantification of bovine DNA in meats，milks and cheese[J].Food Control，2007（18)：1149-1158.

[9]Rodrl’guez MA，Garcl’a T，Gonza’lez I，et al.TaqMan realtime PCR for the detection and quantitation of pork in meat mixtures[J].Meat Science，2005，70：113-120.

[10]Fajardo V，González I，Martín I，et al.Real-time PCR for detectionand quantification of red deer（Cervus elaphus)，fallow deer（Dama dama)，and roe deer（Capreolus capreolus)in meat mixtures[J].Meat Science，2008，79（2)：289-298.

[11]Tanabe S，Hase M，Yano T，et al.A real-time quantitative PCR method for pork，chicken，beef，mutt on and horseflash in food[J].Biosci Biotechnol Biochem，2007，71（12)：3131-3135.

[12]J Chisholm，C Conyers，C.Booth，et al.The detection of horse and donkey using real-time PCR[J].Meat Science，2005，70（4)：727-732.

[13]John J Dooley，Kelly E Paine，Stephen D Garrett，et al. Detection of meat species using TaqMan real-time PCR assays [J].Meat Science，2004，68（3)，431-438.

[14]Yajun Wu，Ying Chen，Bin Wang，et al.Application of SYBRgreen PCR and 2DGE methods to authenticate edible bird’s nest food[J].Food Research International，2010，43（8)：2020-2026.

[15]中国检验检疫科学研究院.鱼翅实时荧光PCR鉴别的引物及探针、试剂盒和方法[P].中国专利：CN201010555570.9，2011-02-16.

[16]广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广州市振烨生物科技有限公司.冬虫夏草的鉴别及检测方法和试剂盒[P].中国专利：CN200910213616.6，2011-06-8.

[17]中国检验检疫科学研究院.用于马鹿茸真伪鉴别的引物及探针、试剂盒和方法[P].中国专利：CN201010555564.3，2011-02-16.

[18]中国检验检疫科学研究院.用于梅花鹿茸真伪鉴别的引物及探针、试剂盒和方法[P].中国专利：CN201010555571.3，2011-02-16.

[19]徐君怡，曹际娟，王长文，等.虎制品的SYBR Green I实时荧光PCR特异性鉴定[J].东北林业大学学报，2010，38（10)：82-84.

[20]徐君怡，曹际娟，王秋艳，等.SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测鉴定狮制品[J].野生动物，2010，31（4)：171-174.

[21]董文斌.掺假食品的识别与检验[M].西安：西北大学出版社，2001.

[22]杨光，王加启，卜登攀，等.乳及乳制品蛋白质掺假检测研究进展[J].食品科学，2010，31（9)：306-312.

[23]岳巧云，陈定虎，伍朝晖，等.实时荧光PCR在鉴别奶粉中掺入大豆成分的应用研究[J].食品科学，2009，30（12)：190-193.

[24]Lo’pez-Calleja I，Gonza’lez I，Fajardo V，et al.Real-time TaqMan PCR for quantitative detection of cows’milk in ewes’milk mixtures[J].Int Dairy J，2007（17)：729-736.

[25]López-Calleja，I González，V Fajardo，et al.Quantitative detection of goats’milk in sheep’s milk by real-time PCR[J]. Food Control，2007，18（11)：1466-1473.

[26]Alba N Mininni，Caterina Pellizzari，Barbara Cardazzo，et al. Evaluation of real-time PCR assays for detection and quantification of fraudulent addition of bovine milk to caprine and ovine milk for cheese manufacture[J].Int Dairy J，2009，19（10)：617-623.

[27]刘学铭，肖更生，陈卫东.果汁鉴伪技术研究进展[J].食品与发酵工业，2006，32（6)：87-91.

[28]苏光明，胡小松，廖小军，等.果汁鉴伪技术研究新进展[J].食品与发酵工业，2009，35（6)：151-156.

[29]Mort on A，Adams A N，Barbara D J.Rapid PCR-based identification of apple（Malus)cultivars and species[J].BCPC Monograph，1993，54：289-294.

[30]韩建勋，黄文胜，吴亚君，等.果汁中梨成分分子生物学鉴伪—实时荧光PCR方法研究[J].中国食品学报，2010，10（1)：207-212.

[31]Palmieri L，Bozza E，Giongo L.Soft fruit traceability in food matrices using real-time PCR[J].Nutrients，2009，2（1)：316-328.

[32]Beatriz Herrero，Juan M Vieites，Montserrat Espiñeira. Authentication of atlantic salmon（Salmo salar)using real-time PCR[J].Food Chemistry，2011，127（3)：1268-1272.

[33]Sanchez，J Quinteiro，M Rey-Mendez.Identification of European Hake species（Merluccius merluccius)using real-time PCR[J].Agric Food Chemistry，2009，57（9)，3397-3403.

[34]Beatriz Herrero，Maria Madrin án，Juan M Vieites，et al. Authentication of atlantic cod（Gadus morhua)using real time PCR[J].Agric Food Chemistry，2010，58（8)，4794-4799.

[35]鶴田 小百合，坂本 智徳，赤木 浩一等.リアルタイムPCR法によるスケトウダラ卵加工品中のマダラ卵およびカラフトシシャモ卵の検出[J].食品衛生学雑誌，2010，51（3)：110-114.

[36]Taylor MI，Fox C，Rico I，et al.Species-specific TaqMan probes for simultaneous identification of（Gadus morhua L.)，haddock（Melanogrammus aeglefinus L.)and whiting（Merlangius merlangus L.)[J].Molecular Ecology Notes，2002，4（2)：599-601.

[37]Itziar Lopez，Miguel Angel Pardo.Application of relative quantification TaqMan real-time polymerase Chain reaction technology for the identification and quantification of thunnus alalunga and thunnus albacares[J].Agric Food Chem，2005，53（11)，4554-4560.

[38]张海亮，吴亚君，陈银基，等.食用油中DNA提取方法的研究进展[J].食品与发酵工业2010，36（11)：128-132.

[39]宋鹏，张明，曹刘霞，等.食用油脂掺入异种油脂检测方法研究进展[J].粮食与油脂，2009（11)：4-8.

[40]覃文，董洁，邓鸿铃.实时荧光PCR定性定量检测混合食用油脂中的花生油成分[J].中国油脂，2006，31（10)：73-76.

[41]栾凤侠，张洪祥，白月.食用油脂中DNA高效快速提取方法及实时荧光PCR检测技术的研究[J].中国油脂，2005，30（7)：41-43.

Application of real-time fluorescent PCR in detection of food authenticity

LI Fu-wei1，2，GAO Qin1，ZHANG Shu-ya1，*，CHEN Hong-chao1，BAO Jian-qiang2，GUO Yun-xia2
（1.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine，Shanghai 200135，China;2.College of Food and Technology，Shanghai University，Shanghai 201306，China)

Real-time Fluorescent PCR which has the character of differential，sensitive，convenient and fast virtues，has been used in detection of food authenticity.The principle of real-time fluorescent PCR was discussed and expatiated its application in detection of meat products，high value food，dairy product，fruit juice，aquatic products and edible oils.

food;authentication;real-time fluorescent PCR

TS201.1

A

1002-0306（2012)14-0367-04

2011－11－18 *通讯联系人

李富威（1985-)，女，硕士研究生，主要从事食品保鲜及分子生物学检测技术研究。

上海出入境检验检疫局科研项目（HK002-2012)。