熊胆粉对小鼠肝癌H22的抑制作用及量效关系研究

王 硕，睢大，陈志鸿，惠 敏，陈丽玲，王 琦，曲绍春，于晓风，富 力

(1.吉林农业大学中药学院，吉林 长春 130118；2.吉林大学药学院，吉林 长春 130021；3.福建归真堂药业股份有限公司，福建 福州 350000；4.大连富生天然药物开发有限公司，辽宁 大连 116000)

熊胆为熊科(Ursidae)动物黑熊Selenaretos thibetanus Cuvier或棕熊Ursus arctos Linnaeus的干燥胆[1]，熊胆粉为经胆囊手术引流胆汁而得的干燥品。熊胆具有解热镇痛、镇咳、镇静、抗惊阙、解痉、保肝、利胆、抑菌及对心血管病、抗病毒、抗炎、抗菌、预防胆结石及溶解胆石等作用[2]。近年研究发现,熊胆粉对肿瘤细胞的增长有一定抑制作用，但尚未见抗肝癌的报道。为了系统开发利用熊胆这一中药资源，本文采用小鼠体内移植性肿瘤肝癌H22模型，对熊胆粉抗肝癌药效及量效关系进行了研究。

1 材料

1.1 药物 熊胆粉(白色粉末)，福建归真堂药业股份有限公司提供，批号20100521，使用时以蒸馏水配成不同浓度；环磷酰胺(规格:200 mg/支)，江苏恒瑞医药股份有限公司提供，批号20100318，使用时以蒸馏水配成0.1%溶液。

1.2 动物 昆明种小鼠，6～8周龄，体质量18～22 g，雄性，合格证号SCXK-(吉)2007-0003，由吉林大学实验动物中心提供。实验前在实验室常规饲养1周。

1.3 细胞株 小鼠肝癌H22由吉林省肿瘤研究所提供，经本实验室传代保存。

2 方法

将小鼠按体质量随机分为7组，即：对照组(给予蒸馏水)；阳性药物组(给予环磷酰胺20 mg/kg)及熊胆粉5个剂量组(分别给予熊胆粉100、200、400、800、1 600 mg/kg)。按抗肿瘤药物实验方法制备体内移植性肿瘤模型[3-4]，取接种于昆明种小鼠第7天的肝癌H22腹水，在无菌条件下配制成瘤细胞悬液，调整活细胞数为1×107/mL，接种于昆明种小鼠左腹股沟皮下，每只小鼠接种0.2 mL。接种次日起给药，各组均每日灌胃给药1次，给药容量为 0.2 mL/10 g，共12 d。于停药后24 h称取动物的体质量，颈椎脱臼处死荷瘤小鼠，剥离肿瘤组织，称重。摘取胸腺、脾脏、肝脏称重，计算胸腺指数、脾指数及肝指数。结果以肿瘤生长抑瘤率表示：

抑瘤率=(1-实验组平均瘤重/对照平均瘤组)×100%

取符合实验标准要求(对照组平均瘤重>1 g，且瘤重<400 mg的动物数不超过总数的20%)的试验结果进行统计学分析。

3 结果

3.1 熊胆粉对小鼠肝癌H22的抑制作用 见表1。

表1结果显示，阳性药环磷酰胺20 mg/kg对肝癌H22的抑瘤率为86.68%，熊胆粉100、200、400、800、1 600 mg/kg 5个剂量组对肝癌H22的抑瘤率为36.00%、52.81%、61.44%、51.39%及45.96%，提示熊胆粉在200～800 mg/kg剂量范围内，对肝癌H22的抑瘤率较高，可达50%～60%。

表1 熊胆粉对小鼠肝癌H22的生长抑制作用(±s)

3.2 熊胆粉对肝癌H22小鼠脏器指数的影响 见表2。

表2 熊胆粉对肝癌H22小鼠脏器指数的影响(±s)

表2结果显示，阳性药环磷酰胺可使肝癌H22小鼠的体质量、胸腺指数、脾指数及肝指数均明显降低，而熊胆粉5个剂量组对肝癌H22小鼠的体质量、胸腺批数、脾指数及肝指数均无明显影响。

4 讨论

熊胆的化学成分比较复杂，包括胆汁酸类、胆固醇类、胆色素类、氨基酸类，还有微量元素。胆汁酸类中含有胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸等，其中熊去氧胆酸即3α、7β-二羟基-5β-胆烷酸是中药熊胆的主要成分[5]。 中医药古籍和传统方剂中涉及熊胆方剂有366个之多,主要功效包括清热解毒、明目退翳、生肌美颜、消肿止痛等[5]。近年来研究[6]表明，熊胆粉的化学成分主要为胆汁酸类，其中熊去氧胆酸是熊胆粉的主要成分。李丽敏等[7]通过HPLC-ELSD法测定了熊胆粉提取物中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量。郑兴等[8]以吡啶-苯甲酰氯为柱前衍生化试剂，以RP-HPLC测定了熊胆粉中牛黄去氧胆酸的含量。王春青等[9]研究发现熊胆粉可有效清除亚硝胺前体物-亚硝酸钠，并能阻断二甲基亚硝胺在体外合成，其清除率与阻断率呈量效关系，表明熊胆粉具有预防某些癌症作用。孙铁民等[10]用熊胆对K562、SP20肿瘤细胞株和小鼠S180腹水癌抑瘤实验，发现熊胆粉有抑制肿瘤细胞生长、延长生存期、提高免疫功能的作用。

本实验结果表明，熊胆粉100～1 600 mg/kg剂量对肝癌H22的抑瘤率在36.00%～61.44%之间，均表现出良好的抗肝癌H22活性，以200～800 mg/kg剂量范围对肝癌H22的抑瘤率最高，可达50%～60%。因此，确定其抗肝癌H22的3个最佳剂量为200、400、800 mg/kg，为进一步开发中药熊胆提供了初步的科学依据。

[1]邓明鲁.中国动物药资源[M].北京:中国中医药出版社,2007:308.

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[3]李仪奎.中药药理实验方法学[M].上海:上海科学技术出版社,1991:513.

[4]韩锐.抗癌药物研究与实验技术[M].北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1997:297-298.

[5]王露霏,曲晓波,胡丽娜,等.动物药整理研究:熊胆[J].吉林中医药,2009,29(3):238-240.

[6]杨继凡,王亦兵.熊脱氧胆酸的药理作用和临床作用[J].新药与临床,1985,4(3):23.

[7]李丽敏,钱大公,王柯,等.熊胆粉提取物中熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸的HPLC-ELSD测定[J].中国医药工业杂志,2009,40(1):39-40.

[8]郑兴,金东日.柱前衍生RP-HPLC测定熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸的含量[J].辽宁中医杂志,2010,37(12):2428-2429.

[9]王春青,吕树臣.熊胆的药理作用与开发利用[J].当代畜牧,2003,11(2):35-36.

[10]孙铁民,梁伟,张启明,等.熊胆抑瘤作用研究[J].辽宁中医杂志,2003,30(1):63.