青霉纤维素酶酶解芦竹的研究

叶艳平,周玉杰,丁一刚,刘 靖,张建安

(1.武汉工程大学 绿色化工过程教育部重点实验室,湖北 武汉 430073;2.清华大学 核能与新能源技术研究院，北京 100084)

纤维素酶为诱导型复合酶系，是生物降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，主要由葡聚糖内切酶(Cx酶)、葡聚糖外切酶(C1酶)、β-葡萄糖苷酶(CB酶)组成[1,2]，其中前两者将纤维分解成纤维二糖，后者将纤维二糖转化为葡萄糖，当三者的活性比例适当时，就能有效地协同完成对纤维素的降解[3,4]。国内外对木霉纤维素酶研究较多[5,6]，但该酶系普遍存在着β-葡萄糖苷酶活力很低的缺陷，致使纤维二糖积累，影响了酶解效率。相对于木霉属的微生物而言，青霉属(Penicillium)真菌不仅能分泌较全的降解天然木质纤维材料的聚糖酶系，而且能产生较多的β-葡萄糖苷酶[7,8]。

作者在此以蒸汽爆破预处理后的芦竹为原料，研究青霉纤维素酶酶解芦竹的适宜条件，同时探讨了向青霉纤维素酶中添加一定量的商业酶后的酶解效果，拟为利用芦竹糖化发酵制取燃料乙醇和丁醇提供理论依据。

1 实验

1.1 材料与试剂

蒸汽爆破预处理后芦竹，其组分为：纤维素46％，半纤维素8％，木质素33％，灰分13％。

青霉纤维素酶液，自制。

商业纤维素酶：NS50013(70 FPU·mL-1DM)、NS50010(250 CBU·mL-1DM)，诺维信公司；木聚糖酶(Xylanase)。

1.2 纤维素酶酶解单因素实验

在50 mL三角瓶中，取蒸汽爆破预处理后芦竹使其底物质量浓度为2％，加入5 mL 1 mol·L-1醋酸缓冲溶液和一定量纤维素酶，在一定转速恒温摇床中于45 ℃、pH值4.8、酶载量30 FPU·g-1DM条件下酶解72 h。离心，取上清液适当稀释，测定还原糖浓度。

固定其它反应条件，依次改变酶解时间(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h)、酶解温度(30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、60 ℃)、pH值(3.5、4.0、4.8、5.6、6.5)、酶载量(10 FPU·g-1DM、20 FPU·g-1DM、30 FPU·g-1DM、40 FPU·g-1DM、50 FPU·g-1DM)，考察各因素对酶解效果的影响。

1.3 混合商业酶酶解实验

1.3.1 外加木聚糖酶单因素实验

添加木聚糖酶混合至酶液总木聚糖酶酶活(IU·g-1DM)依次达到：140、150、160、170、180、190、200，酶解芦竹后测定其还原糖含量。

1.3.2 外加NS50010酶液单因素实验

添加NS50010酶液混合至酶液总β-葡萄糖苷酶酶活(CBU·g-1DM)依次达到：10、20、30、40、60、90、150，酶解后测定其还原糖含量。

1.3.3 酶解效果对比

就以下不同酶系的酶解效果进行对比：30 FPU·g-1DM青霉纤维素酶(酶系1)、30 FPU·g-1DM青霉纤维素酶加木聚糖酶至180 IU·g-1DM(酶系2)、30 FPU·g-1DM青霉纤维素酶加NS50010至β-葡萄糖苷酶40 CBU·g-1DM(酶系3)、30 FPU·g-1DM NS50013酶(酶系4)。

1.4 酶活测定

酶活力测定采用NREL推荐的标准方法[9]。一个滤纸酶活力的国际单位(FPU)等于在标准反应条件下每分钟释放1 μmol葡萄糖的酶量。葡聚糖内切酶酶活用羧甲基纤维素(CMC)测定；β-葡萄糖苷酶酶活用水杨素试剂测定；木聚糖酶酶活用木聚糖溶液测定。

1.5 还原糖含量测定

采用LC-20D型高效液相色谱仪测定酶液中的还原糖，如葡萄糖、木糖等的含量。色谱条件：色谱柱为HPX-87H有机酸分析柱，柱温65 ℃，流动相为5 mmol·L-1稀硫酸，流速0.8 mL·min-1,检测器RID-10A。

2 结果与讨论

2.1 各纤维素酶酶活比较

比较发现，不同纤维素酶的酶活和酶系组成都各不相同，青霉纤维素酶的β-葡萄糖苷酶酶活偏低，仅为0.9 CBU·mL-1，其滤纸酶酶活、木聚糖酶酶活、CMC酶活分别为5.2 FPU·mL-1、42.5 IU·mL-1、15.4 U·mL-1；Xylanase的木聚糖酶酶活较高，为2503.2 IU·mL-1，且检测不到其它酶活性;NS50013的滤纸酶酶活和NS50010的β-葡萄糖苷酶酶活较高，分别为70 FPU·mL-1DM和250 CBU·mL-1DM。

2.2 青霉纤维素酶酶解芦竹工艺条件优化

2.2.1 酶解时间对酶解效果的影响(图1)

图1 酶解时间对酶解效果的影响

由图1可知，酶解初期(1～12 h)反应速度较快，还原糖产率迅速上升；随着酶解时间的延长，反应速度急剧下降；酶解时间超过72 h后，还原糖产率提高不明显。其原因可能是：当酶解时间达到72 h后，酶与底物的反应变缓、酶的活性降低，还原糖的生成趋缓。故选取适宜的酶解时间为72 h。

2.2.2 酶解温度对酶解效果的影响(图2、图3)

图2 酶解温度对酶解效果的影响

由图2可知，随着酶解温度的升高，还原糖产率逐渐上升；酶解温度为45 ℃时达到最大值，之后迅速降低。其原因可能是：酶解温度升高时，酶解液中活化分子数增多,反应速度加快；但酶解温度升至一定程度后,酶蛋白逐渐变性甚至失活,使反应速度降低甚至很快结束。

图3 不同温度下葡萄糖产率随酶解时间的变化

由图3可知，50 ℃和60 ℃下的葡萄糖产率从12 h起即保持几乎不变，即其反应在12 h左右时即将近结束。45 ℃下的葡萄糖终产率最高。

综合上述分析，选取适宜的酶解温度为45 ℃。

2.2.3 pH值对酶解效果的影响(图4)

图4 pH值对酶解效果的影响

由图4可知，酶解效果在pH值4.0～5.5之间较好，这是由纤维素酶蛋白对pH值的敏感性所决定的，其中pH值为4.8时酶解效果最好。因此，选取适宜的pH值为4.8。

2.2.4 酶载量对酶解效果的影响(图5、图6)

图5 酶载量对酶解效果的影响

由图5可知，随着酶载量的增加，葡萄糖的产率明显上升；当酶载量超过30 FPU·g-1DM后，葡萄糖的升幅趋缓，最高葡萄糖产率约66.4％。当酶载量持续增大时,酶解后底物的pH值急剧降低,不利于后期生产。

图6 不同酶载量下葡萄糖产率随酶解时间的变化

由图6可知，当酶载量在40 FPU·g-1DM和50 FPU·g-1DM时，随着酶解的进行，葡萄糖产率开始有起伏波动甚至出现下降的趋势。综合考虑酶解效果和成本因素，选取适宜的酶载量为30 FPU·g-1DM。

通过单因素实验分析，确定青霉纤维素酶酶解芦竹的最适条件为：酶解时间72 h、酶解温度45 ℃、pH值4.8、酶载量30 FPU·g-1DM，在此条件下，葡萄糖产率为(61.75±1.22)％、木糖产率为(40.07±6.88)％。

2.3 混合纤维素酶和商业酶酶解效果对比

2.3.1 外加木聚糖酶酶载量对酶解效果的影响(图7)

图7 外加木聚糖酶酶载量对酶解效果的影响

由图7可知，随着木聚糖酶酶载量的增加，还原糖产率明显上升；木聚糖酶酶活为180 IU·g-1DM时，还原糖产率最高，此后葡萄糖产率略有下降，木糖产率明显下降。最高的葡萄糖产率为69.82％、木糖产率为60.50％，相对于单独青霉纤维素酶酶解的最高葡萄糖产率62.97％和木糖产率46.95％，分别提高6.85％和13.55％。

2.3.2 外加NS50010酶载量对酶解效果的影响(图8)

图8 外加NS50010酶载量对酶解效果的影响

由图8可知，随着外加NS50010酶载量的增加，葡萄糖的产率逐渐上升、木糖产率迅速上升；当酶载量为40 CBU·g-1DM时，葡萄糖产率和木糖产率均达到最高；此后再增加NS50010酶载量，葡萄糖产率几乎不变、木糖产率略有下降。最高的葡萄糖产率为68.96％、木糖产率为98.16％，相对于单独青霉纤维素酶酶解的最高葡萄糖产率62.97％和木糖产率46.95％，分别提高5.99％和51.21％。添加NS50010时木糖产率显著提高，且高于添加木聚糖酶的效果，其原因可能为：青霉纤维素酶中木聚糖酶酶活与滤纸酶酶活比例已达到一定理想值，单独添加木聚糖酶提高该比例只能一定程度上提高酶解效率；而青霉纤维素酶中β-葡萄糖苷酶酶活与滤纸酶酶活比例较低，当添加一定的NS50010提高该比例后，有效地提高了各酶之间的协同作用，从而得到较好的酶解效果。

2.3.3 不同酶酶解效果对比(图9)

图9 不同酶的酶解效果对比

由图9可知，青霉纤维素酶加NS 50010 至β-葡萄糖苷酶40 CBU·g-1DM(酶系3)时木糖产率最高，为98.16％，高于单独30 FPU·g-1DM NS50013(酶系4)的84.88％。补加木聚糖酶(酶系2)或NS50010(酶系3)，均能提高葡萄糖产率，且接近商业酶NS50013单独酶解效果。故通过调节酶系中不同酶活比例，可以达到较好的协同作用，并获得较好的酶解效果。

3 结论

(1)青霉纤维素酶酶解芦竹的最适条件为：酶解时间72 h、酶解温度45 ℃、pH值4.8、酶载量30 FPU·g-1DM，在此条件下，葡萄糖产率为(61.75±1.22)％、木糖产率为(40.07±6.88)％。

(2)通过添加不同商业酶如木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶，调节纤维素酶酶系中不同酶活比例，可一定程度上提高酶解效率。当添加β-葡萄糖苷酶至40 CBU·g-1DM时，葡萄糖产率达68.96％、木糖产率达98.16％。

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