细胞培养稳定同位素标记技术的发展及其在脑病研究中的应用

朱 丽，刘 安，杨洪军，陈 畅，李德凤，吴传鸿，高 健，李韶菁

(1.江西中医学院，江西南昌 330006;2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700;3.河北大学药学院，河北保定 071002)

脑病是指脑组织结构和生理功能异常的疾病，脑萎缩和老年痴呆、脑瘫、帕金森病、癫痫、脑血栓后遗症和中风偏瘫，被国际医学界并称为5大脑病。上述脑病，究其病因虽是脑神经和脑血管两大因素，但其复杂性使之成为21世纪研究的热点，医学界的难题。对于脑病的研究，过去一般是采用非动态、局部、靶向性的方法。稳定同位素标记(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)技术，作为新兴的定量蛋白质组学研究技术，可以明显提高蛋白质鉴定的特异性，敏感性和准确性，是从系统角度研究复杂性问题，符合网络药理学的理念，可以全面揭示脑病的发生机制，为动态、系统地定性和定量分析脑病提供了有效工具。随着SILAC技术的不断发展，其应用范围也从最初的细胞系扩展到整体动物水平，具体的应用策略也在不断完善发展，本文主要就其进展及其在脑病研究中的应用做一概述。

1 SILAC技术的原理与优势

1.1SILAC技术的基本原理SILAC技术是在细胞培养过程中利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术对蛋白表达进行定量分析的一种新技术。SILAC的基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞进行若干倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全参入到细胞新合成的蛋白质中，替代了原有氨基酸，不同标记的细胞按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定［1－2］。SILAC技术作为一种体内代谢标记技术，目前标记的氨基酸种类已扩展到亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸［3－4］等。

1.2SILAC技术的优势SILAC技术较其他标记技术具有不可替代的优势，它是一种体内代谢标记技术，标记效率高，不需要样品预处理，具有高通量性等突出优势;样本需求量少、操作简单、定量精确;适合于大分子量、复杂生物样品分析，可以鉴定出更多的低丰度蛋白(包括细胞表面蛋白、细胞器特异性蛋白以及磷酸化蛋白或糖蛋白这些经过翻译后修饰的蛋白);体内代谢标记与聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)或色谱分离技术相结合，兼容疏水性蛋白和偏碱性蛋白，不受蛋白性质限制，可以研究某些疏水性蛋白质如膜蛋白、等电点极酸或极碱的蛋白质以及分子量极大或极小的蛋白质;可以进行细胞信号转导的动态变化研究。SILAC技术除在全面、精确定量差异蛋白质组研究方面发挥作用外［5－6］，其在研究生化代谢、分子信号通路、蛋白质翻译后修饰［7］(如磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化等)、时空动态变化的蛋白质［8］和蛋白质相互作用［9］等方面亦具有明显优势。目前SILAC结合质谱技术应用范围已从细胞系扩展到亚细胞器、组织与动物整体水平［10－12］，甚至已成功用于原代细胞培养［13－16］。

2 SILAC技术的发展

SILAC结合质谱技术作为定量蛋白质组学的一个重要方法，其应用处于不断发展和创新中。其应用范围从最初的细胞系扩展到整体动物水平。在细胞方面，从只用于传代细胞的经典SILAC技术，发展到可以进行原代细胞培养的多重SILAC技术，进而发展到可以用于组织样本的超级SILAC的方法。

2.1SILAC技术在细胞方面的研究进展

2.1.1经典SILAC技术经典的SILAC技术是一种完全标记的绝对蛋白质定量方法，稳定同位素标记的氨基酸与天然氨基酸化学性质基本相同，对细胞无毒性，因而它所标记的细胞和未标记细胞在生物学行为上几乎没有差异，标记效率可高达100%。经典的SILAC技术是分别用含轻型稳定同位素(天然同位素)和重型稳定同位素标记的必需氨基酸的培养基，对处于两种不同状态的细胞(如一种为正常细胞，另一种为病理状态的细胞)分别进行培养标记，细胞经至少6个细胞倍增周期被完全标记后，将经过轻、重型稳定同位素标记的两种细胞等数量混合，将分别提取的蛋白等比例混合后经SDS－PAGE分离，酶解提取肽，进行质谱检测，通过质谱图上一对轻重稳定同位素峰的比例可以反映对应蛋白在不同状态下的表达水平(Fig 1)。经典的SILAC标记方法主要用于定量分析样品间的蛋白质表达差异，可以应用于检测蛋白质在某些生物过程中的动态变化。

Fig 1 Experiment process of classic SILAC technology［1 －2］

2.1.2多重SILAC技术经典的SILAC技术不适用于不可传代或者不稳定的细胞，多重SILAC技术是使用多组重质氨基酸进行标记，是一种相对定量的不完全标记技术［17］(Fig 2)，可用于原代细胞的培养。多重SILAC对同一种细胞标记两种以上不同的重质氨基酸，细胞中所含重质氨基酸比重的动态变化反映了蛋白质表达量的不同，是一项相对精度较高的质谱定量技术。但由于SILAC技术需采用透析后血清，培养条件相对贫乏，为保持不可传代细胞的生物学特性，需对细胞培养条件进行摸索，使之既满足SILAC标记要求，同时也可以维持细胞的正常功能。

Fig 2 Multiplex SILAC［17］ technology

2.1.3超级SILAC技术超级 SILAC(Super-SILAC)技术的出现扩大了SILAC技术的应用范围，使之既能够测出不可传代细胞，而且可以对多种不同类型的细胞同时测定。Super-SILAC方法是将重质标记的细胞样品作为参照体系，然后将这一参照样品与组织样品等量混合比较，不同的组织样品之间以参照样品的相对量为标准进行比较，这一方法使SILAC在组织样本上的应用也得到推广。这种Super-SILAC技术可以应用于蛋白质生物标识的发现。Geiger等［18］用重氨基酸标识了含有不同癌症细胞系的混合物，用5种标记方法混合，精确测定出人类原发性肿瘤组织中的蛋白质(Fig 3)。

Fig 3 Heavy amino acid identity Super-SILAC technology［18］

2.2SILAC技术在整体动物方面的研究进展SILAC技术目前主要应用在细胞水平，但在整体动物方面的研究也开始进行。体内稳定同位素标记法有一个明显优点是在样品制备的初期，蛋白质就被标记，从而减少了样品间由于实验操作造成的差异，有利于提高定量的准确度。采用纯系小鼠分别饲以含重型稳定同位素和含天然或轻型稳定同位素氨基酸的饲料，至少传代6代以上(保证重型稳定同位素标记高的结合率)。然后对动物模型进行药物处理，取样后提取蛋白质，与重稳定性同位素标记的小鼠样品进行等量混合，利用高分辨质谱寻找表达差异的标志蛋白，并对鉴定的蛋白质进行定量，可分析和研究药物作用机制。Kruger等［12］将组织标记技术应用到基因敲除小鼠上(Fig 4)，揭示了Kindlin-3蛋白在红细胞中具有重要作用，是红细胞发挥正常功能的必要因子。该方法是定量比较基因敲除小鼠蛋白质组的通用工具，可利用其确定蛋白质在复杂体内条件下的功能。

Fig 4 Mice are fed with heavy isotope［12］

3 SILAC技术在脑病研究中的应用

脑病是一类复杂的、难治愈的疾病，目前针对脑病的研究缺乏有效的方法。SILAC技术作为一种多靶点、多途径的研究方法，能够系统、动态地分析脑病发生和发展过程中蛋白质表达谱的变化，符合网络药理学的理念，为寻找脑中特异的蛋白标志物，进行疾病机制深入研究和药物治疗提供了新的思路。但目前SILAC技术在脑病研究中的应用尚处于起步阶段，相关报道较少［19］，主要有以下几个方面:

以脑中风神经血管单元研究为例阐述SILAC的应用，神经血管单元作为一个独立的功能单位，主要由原代神经元、星形胶质细胞、微血管内皮细胞及其基质组成，通过不同策略的SILAC技术进行对神经血管单元中不同细胞进行标记:针对原代神经元细胞和星形胶质细胞采用多重SILAC标记方法进行标记(multiplex SILAC labeling)，微血管内皮细胞系为可传代细胞，采用经典SILAC技术。然后对3种细胞加入损伤因素和药物干预，对处理的不同标记的细胞等量混合，进行LC-MS分析，鉴定其中的蛋白质并进行定量。还可采用Super-SILAC技术直接提取脑组织，用重氨基酸标识神经血管单元里不同细胞的混合物，在组织水平上鉴定蛋白质。使用神经血管单元作为体外研究脑缺血的模型，有利于有效地将SILAC定量技术与脑卒中微环境的研究结合起来，而且利用这个模型发现的新靶标可以进一步在整体动物模型中进行验证，形成了完整的脑卒中相关细胞的定量蛋白质组学SILAC研究策略。

Yang等［20］使用SILAC技术分析糖氧剥夺后sumo3表达的改变，找到了一些可能与sumo相关的信号通路和恢复缺血性应力的通路。

阿尔采末症(Alzheimer’s disease，AD)是由于脑内神经结构发生病变而引起的老年性痴呆症，有文献证明小胶质细胞可能在其发病机制中发挥重要作用。Liu等［21］利用SILAC技术探讨AD发病机制，通过内毒素预处理1h的小胶质细胞与空白组进行比较，确定了77种分泌蛋白，其中28种与细胞溶酶体相关，13种溶酶体蛋白表达差异有显著性，证明了小胶质细胞释放的一些溶酶体酶可能参与神经元损伤过程。应用SILAC技术能够系统地解析疾病涉及信号网络，预测某些关键信号蛋白，为深入的功能研究指出方向。

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种严重影响患者活动能力的中枢神经系统慢性疾病，目前公认其病因是神经细胞的退行性变，大脑黑质神经元数量减少，多巴胺合成不足，但其深入的病机尚不清楚。Jin等［22］利用SILAC技术比较鱼藤酮对线粒体蛋白质(多巴胺)的影响，确定了1 722个蛋白质，在950个线粒体蛋白质中，在鱼藤酮处理之后有110个有相对丰度的明显差异变化。进一步表明这些蛋白质可能阐明PD发病机制。

4 展望

中药具有多靶点、多向调节、防治结合的特点，虽早已被广泛应用于脑病临床治疗，但由于其成分复杂，缺乏有效研究手段，作用机制无法阐释清楚。将SILAC这种系统、高通量的定量蛋白质组技术应用于复杂脑病的研究，并将其作为治疗脑病中药研究的手段，探索适合中医药特点的新研究模式，是一个相对新的思路，但如何联合不同策略的SILAC技术，有效并更适合应用于神经系统疾病如脑中风、AD、PD的研究，更深入地阐明中药复方的药效物质基础、多成分交互作用机制及其组方的科学内涵，仍需进一步探讨。

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