PHⅡ-7通过升高ROS诱导K562和K562/A02凋亡

彭洪薇，袁向飞，李真真，颜次慧，李双静，张砚君

(中国医学科学院·北京协和医学院血液病医院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室，天津 300020)

肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是临床肿瘤治疗中一个导致化疗失败的主要原因之一［1］。靛玉红是当归龙荟丸的一种有效抗肿瘤成分，人们将当归龙荟丸用于治疗慢性粒细胞性白血病，取得了一定的疗效［2］。PHⅡ-7是我们实验室在前期的工作中从靛玉红衍生物中筛选得到的有较好抗肿瘤活性和较低毒性的化合物，其化学结构见Fig 1。与靛玉红相比，PHⅡ-7抗瘤谱更广，对肿瘤细胞的抑制作用也更强;更为突出的是，PHⅡ-7不仅对多种人肿瘤细胞有效，而且对数种人耐药肿瘤细胞也有效［3］。在我们的研究中发现，PHⅡ-7对CML(chronic myeloid leukemia，CML)耐药细胞株K562/A02及其亲代敏感细胞K562具有相同的杀伤作用，但其相关的机制并不明确。

Fig 1 The chemical structure of PHⅡ-7

近年来，一些研究表明某些化疗药具有升高肿瘤细胞内ROS的作用［4］。不仅传统的临床应用化疗药具有升高细胞内活性氧(ROS)水平的作用，一些具有能克服肿瘤细胞耐药的新型化疗药也证实可以升高ROS水平，并且ROS水平的升高与多药耐药相关蛋白(MDR-1)表达的下调呈正相关［5－6］。我们试图从ROS出发，旨在探讨 PHⅡ-7对白血病CML细胞系K562及其相应的耐药细胞系K562/A02杀伤机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1培养基RPMI 1640培养基购自 Gibco公司;胎牛血清购自中国医学科学院天津血研所科技公司。

1.1.2药物PHⅡ-7由我室合成，原药以 DMSO溶解，配制成50 g·L－1贮存液，分装后 －20℃贮存备用，溶解后药物溶液中DMSO的终浓度＜1‰。

1.1.3其他试剂二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，活性氧探针DCFH-DA及NAC购自江苏海门碧云天生物研究所，细胞凋亡检测试剂盒apoptosis I购自美国碧迪公司。Cell counting kit-8 reagent购自日本同仁化学研究所，抗PARP、caspase-3、caspase-9及GAPDH抗体均为Cell Signaling Technology公司产品。

1.1.4细胞株及细胞培养人白血病细胞株K562，及其相对应的耐药细胞株K562/A02由本室保存。于10%胎牛血清RPMI 1640培养基中，5%CO2，37℃孵箱中培养，取对数生长期的细胞进行试验。

1.1.5试验仪器CO2细胞培养箱，德国Heraeus公司;酶标仪(Bio-tek，USA)，流式细胞仪(BD LSRⅡ，USA)，激光共聚焦显微镜(德国Leika)。

1.2 方法

1.2.1细胞活力检测利用WST-8试剂(Dojindo laboratories，日本同仁化学研究所)测定肿瘤细胞对药物的敏感性。取对数生长期的细胞接种于96孔培养板(每孔15 000个细胞)，培养过夜，次日每孔加入10 μl相应浓度的药物，继续培养72 h，然后每孔加入10 μl CCK-8 试剂，37℃，5%CO2孵箱中继续培养2 h后，酶标仪450 nm测定吸光度。按下列公式计算细胞的存活率及生长抑制率:细胞存活率/%=(加药组平均 OD值/对照组平均 OD值)×100%;生长抑制率/%=(1－加药组平均OD值/对照组平均OD值)×100%，按BLISS法计算机程序求出半数抑制浓度IC50。以上实验平行重复3次。

1.2.2细胞凋亡检测取对数生长期的细胞，稀释接种于6孔板中进行培养(每孔3×105细胞)，相应浓度药物处理24 h后收集细胞。按BD公司AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，冰预冷的PBS洗细胞两遍后，每管加入200 μl稀释后的1×Binding buffer及 AnnexinⅤ-FITC、碘化丙啶(PI)各5 μl，混匀后室温避光孵育 15 min。300 ×g离心 5 min，弃上清，用 500 μl冰预冷的 Binding Buffer重悬细胞，轻轻混匀后用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.3ROS检测取处于对数生长期的细胞，稀释接种于6孔板中培养(每孔3×105细胞)，对照组(细胞未经药物处理)和实验组(药物处理不同时间或不同剂量)后，用终浓度10 μmol·L－1DCFH-DA染料避光孵育30 min，收集细胞，冰预冷的PBS洗涤两次后用流式细胞仪检测细胞内的ROS水平。

1.2.4激光共聚焦实验分别收集对照组和实验组细胞，调整细胞浓度为5×108·L－1，取干净的载玻片，于甩片机中甩片30 s，观察甩片后细胞形态正常后于湿盒中放置过夜。取前1 d已晾干的载玻片，在细胞团块上滴加20 μl固定液固定13 min，后用PBS用洗两遍，加入终浓度1 mg·L－1的DAPI染色5 min，PBS洗涤后可于共聚焦显微镜下观察。

1.2.5Western bolt检测凋亡相关蛋白的表达变化取处于对数生长期的K562及K562/A02细胞，稀释接种于6孔板中培养，其中实验组分别进行如下处理:2 μmol·L－1PHⅡ-7 孵育 24 h;5 mmol·L－1NAC 孵育24 h 或5 mmol·L－1NAC 与2 μmol·L－1PHⅡ-7共孵育24 h，分别收集对照组和处理组细胞，RIPA裂解后蛋白定量并用于Western blot检测。首先进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白样品转移至硝酸纤维素(NC)膜，封闭后分别孵育PARP-1抗体(1 ∶1 000)、caspase-3、caspase-9抗体(稀释比例均为1∶1 000)及GAPDH抗体(1∶2 000)室温孵育2 h，再与二抗室温孵育1 h，化学发光法发光曝片。

1.2.6统计学处理所有数据均以±s表示，结果重复3次，显著性检验采用t检验。

2 结果

2.1PHⅡ-7对K562和K562/A02细胞增殖的影响K562/A02是本室建立的对多种化疗药具有交叉耐受性的肿瘤细胞株，经检测，它对阿霉素的IC50为其亲代细胞K562的约100倍［7］。本研究中测定了K562和K562/A02对PHⅡ-7的敏感性，WST-8试验表明，PHⅡ-7对K562和K565/A02的细胞增殖有明显的抑制作用，呈现明显的剂量依赖性，其IC50值分别为(2.78±0.31)和(1.97 ±0.38)μmol·L－1(Fig 2)。

Fig 2 Effect of PHⅡ-7 on K562 and K562/A02 cell’s proliferation

2.2PHⅡ-7作用后细胞内ROS水平的变化2 μmol·L－1PHⅡ-7分别作用K562和K562/A02细胞0、0.5、1、2、3、4、6、8、9.5、11、24 h 后，流式细胞仪测定ROS水平发现，细胞内的ROS水平发生了明显变化(Fig 3A):在处理2 h后明显升高，处理11 h后升高至峰值(Fig 3B)，上述结果说明PHⅡ-7处理后确实会促使细胞内ROS水平升高。

Fig 3 ROS production generated by PHⅡ-7

2.3PHⅡ-7诱导K562、K562/A02细胞凋亡及与ROS的关系PHⅡ-7处理 K562、K562/A02细胞后，流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示，PHⅡ-7可以诱导上述两种细胞凋亡，并且呈剂量时间及剂量关系(Fig 4A，B);加入 5 mmol·L－1的 NAC 与药物共孵育后，完全抑制了PHⅡ-7引起的细胞凋亡(Fig 3B)。同时，加入不同浓度的 NAC(0、0.625、1.25、2.5 和 5 mmol·L－1)与 2 μmol·L－1的 PHⅡ-7 共孵育，24 h后测定细胞存活率。结果显示，NAC与PHⅡ-7共孵育可以抑制PHⅡ-7引起的细胞凋亡，且随NAC浓度的增加，细胞的生存率逐渐提高，且单用NAC对细胞的生存率没有明显影响(Fig 4C)。

2.4抗氧化剂NAC可以抑制PHⅡ-7作用引起的细胞杀伤效应2 μmol·L－1PHⅡ-7作用 K562、K562/A02细胞后，用1 mg·L－1的 DAPI进行细胞核染色，激光共聚焦显微镜观察发现，与对照相比，细胞核形态发生明显改变，出现凋亡小体;在PHⅡ-7与5 mmol·L-1NAC共孵育组，未见明显的细胞核形态改变及凋亡小体的出现(Fig 5A)。进一步说明PHⅡ-7可以诱导细胞凋亡，而与NAC联用之后，PHⅡ-7引起的细胞凋亡作用被抑制。Western blot分析显示，PHⅡ-7可以引起凋亡信号通路分子PARP-1及caspase-3、caspase-9的切割，提示细胞内凋亡信号系统已经激活。与NAC联用之后，PHⅡ-7引起的上述蛋白质变化消失，而单用NAC对上述细胞凋亡相关蛋白无影响(Fig 5B)，提示抗氧化剂NAC可以抑制PHⅡ-7作用引起的细胞凋亡，从而进一步说明PHⅡ-7引起的细胞凋亡作用与ROS的升高有极大的关联性。

3 讨论

CML是由于多潜能干细胞的异常增殖引起的疾病。尽管酪氨酸激酶抑制剂及一些化疗药物的使用已经极大的提高了CML病人的存活率，仍然有许多病人在治疗一段时间后产生了对上述化疗药的耐药性(MDR)。MDR是导致临床上化疗失败的主要原因之一。引起多药耐药的原因有很多，其中最为人们熟知的是细胞膜表面 P-糖蛋白的高表达［8］。P-糖蛋白(MDR1)是mdr1基因的编码产物，其是一种依赖ATP供能的跨膜外排泵。P-糖蛋白高表达的肿瘤细胞会通过其的外排功能减少细胞内的药物蓄积，从而表现为对常规化疗剂量无效。目前，寻找有效的MDR调节剂(或称抑制剂，逆转剂)，将之与其他化疗药物联用是临床治疗中一个很有希望的治疗策略。PHⅡ-7是我们实验室在前期的工作中从靛玉红衍生物中筛选得到的有较好抗肿瘤活性和较低毒性的化合物，我们发现，其对许多组织来源不同的肿瘤细胞均有抑制作用，是一个很有希望的抗肿瘤药物［9－10］。此外，我们还发现其对许多耐药肿瘤细胞有效［3，9］，经研究发现其可以通过下调 c-fos基因进而降低膜表面MDR1的表达［11］。然而，其对肿瘤细胞的杀伤机制仍然未明，尤其是其对耐药与相应的亲代敏感细胞杀伤机制是否有异同仍然是个问号，因此，探寻PHⅡ-7在敏感和耐药的肿瘤细胞中的具体杀伤机制具有重要意义。

ROS根据其分子类型的不同可分为离子型和非离子型，它们均因分子内含有未配对的电子而具有较高的反应性。细胞内ROS水平的变化可以引起许多下游基因的变化，如NF-κB和AP-1是已经证实能被 ROS 调控的转录因子［5－6，12］。多年来的研究表明，在肿瘤的发生和发展过程中，细胞内的氧化还原系统往往发生异常，造成肿瘤细胞内ROS水平的升高。升高的ROS水平一方面有利于肿瘤细胞获得更多的基因突变，另一方面使得肿瘤细胞对进一步升高的ROS水平较正常细胞更为敏感［12－13］。一旦细胞内的氧化—还原平衡被破坏至细胞不能承受的程度，细胞将会走向死亡。近年来，有研究发现，经外界刺激后，细胞内ROS水平的升高可以下调bcl-2的水平，进而下降线粒体膜电位，诱导细胞凋亡［14］。许多化疗药也被发现具有升高细胞内 ROS的作用，并与其诱导凋亡的作用相关［5，15］。本研究中发现，PHⅡ-7 对 K562/A02 及其亲代K562细胞有相当的细胞增殖抑制作用，呈剂量依赖关系。PHⅡ-7处理细胞之后能引起细胞内明显的ROS的升高，并诱导细胞凋亡。与抗氧化剂NAC共孵育之后，可以极大的抑制细胞凋亡的发生，提高细胞的存活率。故我们认为PHⅡ-7很可能是通过升高细胞内的ROS水平引起了肿瘤细胞的死亡。

Fig 4 Apoptosis induced by PHⅡ-7 in K562 and K562/A02，and the effect eliminated by NAC

Fig 5 Effect of NAC on the apoptotic effect of PHⅡ-7 on K562 and K562/A02 cell lines

综上所述，PHⅡ-7可能通过升高肿瘤细胞内的ROS水平达到杀伤肿瘤细胞的作用。更让人兴奋的是，它对耐药的肿瘤细胞K562/A02同样有效，虽然我们已经证实其与PHⅡ-7下调P-gp和升高它的ROS水平有关，但ROS水平的升高与P-gp调控之间的关系以及对细胞内糖代谢水平的影响仍然未知。下一步我们将就以上两个方面进行深入研究，为PHⅡ-7的临床应用奠定基础。

［1］Teodori，E，Dei S，Martelli C，et al.The functions and structure of ABC transporters:implications for the design of new inhibitors of Pgp and MRP1 to control multidrug resistance(MDR)［J］.Current Drug Targets，2006，7(7):893 －909.

［2］Han L.Traditional Chinese medicine and the search for new antineoplastic drugs［J］.J Ethnopharmacol，1988，24(1):1 －17.

［3］师锐赞，张秀丽，杨 铭，等.PHⅡ-7对人乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/ADR体外杀伤活性和逆转耐药作用［J］.中国癌症杂志，2010，20(5):321－3.

［3］Shi R Z，Zhang X L，Yang M，et al.In vitrocytotoxity and reversal effects of PHⅡ-7 in human multidrug-resistant breast cancer MCF-7/ADR cells［J］.China Oncol，2010，20(5):321 －3.

［4］孙国贵，王雅棣.活性氧与肿瘤［J］.癌变畸变突变，2011，23(1):78 －80.

［4］Sun G G，Wang Y D.Reactive oxygen species and carcer［J］.Carcinog，Teratog＆Mutag，2011，23(1):78 －80.

［5］Cai Y，Lu J，Miao Z，et al.Reactive oxygen species contribute to cell killing and p-glycoprotein downregulation by salvicine in multidrug resistant K562/A02 cells［J］.Cancer Biol Ther，2007，6(11):1794－9.

［6］Miao Z H，Ding J.Transcription factor c-jun activation represses mdr-1 gene expression［J］.Cancer Res，2003，63(15):4527 －32.

［7］杨纯正，栾凤君，熊冬生，等.阿霉素诱导的人白血病细胞系K562/A02多药抗药性［J］.中国药理学报，1995，4(16):333－7.

［7］Yang C Z，Luan F J，Xiong D S，et al.Multidrug resistance in leukemia cell line K562/A02 induced by doxorubicin［J］.Acta Pharm Sin，1995，4(16):333 －7.

［8］Rivera E.Management of metastatic breast cancer:monotherapy options for patients resistant to anthracyclines and taxanes［J］.Am J Clin Oncol，2010，33(2):176 －85.

［9］张砚君，王 锐，邵晓枫，等.PHⅡ-7增强阿霉素杀伤HL-60/ADR细胞的作用及机制研究［J］.中华血液学杂志，2008，19(9):599－602.

［9］Zhang Y J，Wang R，Shao X F，et al.Mechanism of synergistic anti-tumor effect of PHⅡ-7 with doxorubicin on multi-drug resistant HL-60/ADR cells［J］.Chin J Hematol，2008，19(9):599 －602.

［10］谭耀红，齐 静，刘卫军.抗耐药肿瘤新药PHⅡ-7作用机制的初步研究［J］.中国医学科学院学报，2002，24(2):134－9.

［10］Tan Y H，Qi J，Liu W J.Preliminary studies on the mechanisms of a new anti-tumor agent PHⅡ-7 with special preference to multidrug resistant tumor cells［J］.Acta Acad Med Sin，2002，24(2):134－9.

［11］Shi R Z，Li W，Zhang X L，et al.A novel indirubin derivative PHⅡ-7 potentiates adriamycin cytotoxicity via inhibiting p-glycoprotein expression in human breast cancer MCF-7/ADR cells［J］.Eur J Pharmacol，2011，669(1 －3):38 －44.

［12］Locasale J W，Vander Heiden M G，Cantley L C.Rewiring of glycolysis in cancer cell metabolism［J］.Cell Cycle，2010，9(21):4253.

［13］Yeung S J，Pan J，Lee M H.Roles of p53，MYC and HIF-1 in regulating glycolysis-the senventh hallmark of cancer［J］.Cell Mol Life Sci，2008，65(24):3981 －99.

［14］Hildeman D A，Mitchell T，Aronow B，et al.Control of bcl-2 expression by reactive oxygen species［J］.PNAS，2003，100(25):15035－40.

［15］吴克伟，杨 芬，刘俊龄，等.Hirsutanols A通过增加活性氧选择性诱导多西他赛耐药非小细胞肺癌细胞PC14/TXT凋亡［J］.中国药理学通报，2010，26(8):1005－10.

［15］Wu K W，Yang F，Liu J L，et al.Hirsutanols A selectively induced apoptosis in docetaxel resistant NSCLC cells through increasing ROS production［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(8):1005 －10.