响应面优化微波辅助乙醇提取蜂胶黄酮工艺优化

李 帅，赵岩岩，陈晓平

响应面优化微波辅助乙醇提取蜂胶黄酮工艺优化

李 帅，赵岩岩，陈晓平*

(吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118)

对蜂胶中黄酮类化合物提取工艺条件进行优化。采用单因素试验分析微波时间、微波功率、乙醇体积分数、浸提温度、浸提时间、液料比6个因素对总黄酮得率影响，根据中心组合试验设计原理，采用四因素三水平响应面分析法进行响应面试验，并对各个因素的显著性和交互作用进行分析。结果表明，最优工艺条件为微波时间70s、微波功率282W、乙醇体积分数80%、提取温度77℃、浸提时间12h、液料比25∶1(mL/g)，在此条件下，蜂胶总黄酮得率为25.08%。

蜂胶；总黄酮；提取；响应面分析法

蜂胶是蜜蜂从植物树芽、花苞和树干处采集的树胶，并混入蜜蜂上颚腺分泌物和蜂蜡等加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物[1]。蜂胶有“黄酮化合物宝库”之称，其主要活性成分包括黄酮类、萜烯类、有机酸、芳香醛、酯类及多种氨基酸、酶、维生素、矿物质等[2-4]。具有抗真菌，抗病毒和抗肿瘤特性[5]。本实验采用微波法对蜂胶中总黄酮进行提取并测定提取液中总黄酮含量，在单因素试验基础上，利用响应面分析法优化微波法提取蜂胶中总黄酮的工艺条件。旨在为蜂胶黄酮的开发利用提供进一步的参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

粗蜂胶 吉林市毛氏蜜蜂养殖厂。

芦丁(AR) 天津天一方科技有限公司；无水乙醇(AR) 北京化工厂；硝酸铝 中国上海新星精细化工厂；氢氧化钠 天津市科密欧化学试剂有限公司；亚硝酸钠 莱阳化工实验厂；其他试剂均为国产分析纯。

DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；电子恒温水浴锅 天津泰斯特仪器有限公司；LG-10-2.4A高速离心机 北京医用离心机厂；A-20组织粉碎机 金坛市科析仪器有限公司；标准筛(60目) 浙江上虞市道墟仪器筛具厂。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

粗蜂胶置于－20℃冷冻5h，粉碎过60目筛，石油醚回流提取3h脱蜡[6-7]。

1.2.2 总黄酮提取的工艺流程

将预处理后的蜂胶进行微波处理，微波一段时间后用乙醇浸泡一定时间，提取液离心取上清液用乙醇定容至25mL，得蜂胶黄酮样品溶液[8-9]。

1.2.3 黄酮的测定与计算[10]

1.2.3.1 标准曲线的制作

配制一定浓度的芦丁标准液，测定波长510nm处吸光度，以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A＝0.014C＋0.0024，相关系数R2＝0.9996，说明蜂胶中总黄酮在所提取的质量浓度范围内，其质量浓度和吸光度成良好的线性关系。

1.2.3.2 总黄酮含量的测定

吸取0.1mL提取液于10mL容量瓶中，按芦丁标准曲线绘制方法配制溶液，以空白试剂为参比液调零，测其吸光度记为A，测3次取平均值，代入标准曲线得提取液质量浓度C/(μg/mL)，按下式计算蜂胶中黄酮得率(X)。

式中：C为样液质量浓度/(μg/mL)；V0为定容后的体积/mL；V1为样液体积/mL；V2为稀释体积/mL；m为称取蜂胶质量/g。

1.2.3.3 单因素试验

在试验条件：液料比20∶1(mL/g)、乙醇体积分数60%、提取时间4h、提取温度40℃、微波功率240W、微波时间60s不变的情况下，进行单因素试验，参考各因素对蜂胶总黄酮得率的影响。

1.2.3.4 响应面试验设计[11-13]

在单因素试验基础上，利用响应面分析法优化微波辅助乙醇提取蜂胶黄酮工艺条件。综合单因素试验结果，选取微波时间、微波功率、乙醇体积分数、提取温度4个因素，利用Design-Expert 7.0软件设计进行多元回归分析[14-15]。试验方案及结果见表1。

表1 微波辅助乙醇提取蜂胶黄酮工艺优化响应面试验因素水平表Table 1 Factors and their coded levels tested in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 微波时间对蜂胶中总黄酮得率的影响

图1 微波时间对蜂胶中总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of microwave treatment time on extraction rate of flavonoids

由图1可知，随着微波时间的延长，蜂胶中总黄酮得率先增加后减少。在60s达到最大，随着时间的延长，蜂胶中总黄酮的得率逐渐减少。这可能是因为过长的微波时间会导致蜂胶胶质的变化。

2.1.2 微波功率对蜂胶中总黄酮得率的影响

图2 微波功率对蜂胶中总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of microwave power on extraction rate of flavonoids

由图2可知，微波功率对得率影响较大，随着微波功率的增加，蜂胶中总黄酮得率先增加后减少，当微波功率达到240W时蜂胶中总黄酮得率达到最大值，随后微波功率增加总黄酮得率开始减少，这可能是因为在较大的微波功率下部分黄酮被分解的原因。

2.1.3 乙醇体积分数对蜂胶中总黄酮得率的影响

图3 乙醇体积分数对蜂胶中总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of alcohol concentration on extraction rate of flavonoids

由图3可知，随着乙醇体积分数的增加，蜂胶总黄酮得率逐渐增加。这可能是因为随着乙醇体积分数的增大，一些醇溶性杂质、色素等的浸出量也有所增加，从而影响了总黄酮得率。

2.1.4 乙醇提取温度对蜂胶中总黄酮得率的影响

图6 液料比对蜂胶中总黄酮得率的影响Fig.6 Effect of solvent-to-solid on extraction rate of flavonoids

图4 提取温度对蜂胶中总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of flavonoids

由图4可知，随着提取温度的增加蜂胶总黄酮提取率逐渐增加。这可能是因为随着温度的升高，分子运动速度加快，渗透和扩散作用加强，使蜂胶中总黄酮更易于溶出。

2.1.5 提取时间对蜂胶中总黄酮得率的影响

图5 乙醇提取时间对蜂胶中总黄酮得率的影响Fig.5 Effect of extraction time of on extraction rate of flavonoids

由图5可以看出，随着乙醇提取时间的增加，蜂胶总黄酮得率逐渐升高，这可能是因为提取时间越长蜂胶黄酮的溶出量越大。确定最佳提取时间为12h。

2.1.6 液料比对蜂胶中总黄酮得率的影响

由图6可以看出，随着液料比的增加，蜂胶中总黄酮得率有所增加，但增加并不明显，再增加液料比蜂胶中总黄酮得率趋于稳定。可以看出液料比为25∶1时蜂胶中总黄酮已基本溶出。由于过大的液料比会造成溶剂和能源的浪费，从浸提效果和经济两方面综合考虑，确定最佳料液比为25∶1(mL/g)。

2.2 响应面法优化蜂胶中总黄酮提取工艺参数

2.2.1 回归方程的建立与分析

本试验共有29个试验点，其中1～24号为析因试验，25～29号为中心试验，用来估计试验误差。试验方案及结果见表2。利用Design-Expert 7.0软件对表2结果进行统计分析，可建立如下二次回归方程：

表2 微波辅助乙醇提取蜂胶黄酮工艺优化响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

其中二次多项式的相关系数R2＝95.12%、＝90.23%、＝71.87%。与值在一致性上是合理的。所以此模型能被用来指导设计响应面。

表3 响应面试验方差分析Table 3 Variance analysis for the developed regression model

对二次回归方程进行方差分析，结果见表3。从表3可知，回归模型达到极显著水平(P＜0.01)，而误差项不显著，说明回归方程与实际情况吻合得较好，试验误差小。因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。回归系数R2＝0.9512＞0.9，表明该模型相关度好。回归模型各项的方差分析还表明，一次项、二次项、交互项都有较显著影响，所以响应值的变化相当复杂，各个具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，而是呈二次抛物面关系。回归模型中作用显著项是X1、X2、X3、X4、X1X2、X1X3、X2X4、X12、X22、X32、X42。从各变量显著性检验P值的大小，可以看出影响蜂胶黄酮提取效果的各因素按大小排序依次为提取温度＞微波时间＞微波功率＞乙醇体积分数。

2.2.2 响应面及等高线分析结果

为了考察交互项对蜂胶中黄酮效果的影响，在两个因素条件固定不变的情况下，考察交互项对蜂胶中黄酮提取效果的影响，对模型进行降维分析。经响应面7.0软件分析，所得响应面及其等高线见图7。由图7可知，两因素交互作用由大到小为：微波时间和微波功率＞乙醇体积分数和提取温度＞微波时间和乙醇体积分数＞微波时间和提取温度。

图7 各两因素交互作用对蜂胶总黄酮得率影响的响应面及等高线图Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of four process parameters on extraction rate of flavonoids

2.2.3 浸提法提取蜂胶黄酮工艺的优化与验证结果

为进一步确定工艺最佳点，用Design-Expert 7.0软件进行数值优化分析，以获得最优的浸提条件。经分析，最适条件值分别为微波时间69.19s、微波功率282.33W、乙醇体积分数79.87%、提取温度77.06℃，在此条件下蜂胶中黄酮得率为25.41%。考虑到实际工作的便利，将浸提工艺修正为微波时间70s、微波功率282W、乙醇体积分数80%、提取温度77℃。采用修正后的工艺参数进行3次平行验证实验，试验结果测得蜂胶黄酮提取率25.08%，与模型预测值相差不大。证明该模型具有一定的可靠性。

3 结 论

采用浸提技术对蜂胶中总黄酮进行提取，通过单因素试验和响应面分析对浸提工艺进行优化，对微波时间、微波功率、乙醇体积分数、提取温度进行方差分析。结果表明微波时间、微波功率、乙醇体积分数、提取温度对蜂胶黄酮得率有显著影响。模型拟合程度高，试验误差小。

利用响应面方法结合实际可操作性得出最佳工艺条件为微波时间70s、微波功率282W、乙醇体积分数80%、提取温度77℃，该条件下的蜂胶黄酮提取率为25.08%，与模型预测值25.41%相差较小，表明将响应面设计引用到蜂胶黄酮提取工艺中可行，结果可靠。

[1]杨兆起, 封秀娥. 中药鉴别手册∶ 第三册[M]. 北京∶ 科学出版社, 1994∶102.

[2]张源源, 崔同. 总黄酮含量分析法快速评价蜂胶原料质量[J]. 中国食品学报, 2002, 2(3)∶ 46-48.

[3]MELLO B C B S, PETRUS J C C, HUBINGER M D. Concentration of flavonoids and phenolic compounds in aqueous and ethanolic propolis extracts through nanofiltration[J]. Journal of Food Engineering, 2000, 96(4)∶ 533-539.

[4]王贻节. 蜜蜂产品学[M]. 北京∶ 中国农业出版社, 1995∶ 83-89.

[5]BLONSKA M, BRONIKOWSKA J, PIETSZ G, et al. Effects of ethanol extract of propolis (EEP) and its flavones on inducible gene expression in J774A.1 macrophages[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2004, 91(1)∶25-30.

[6]程伟贤, 陈鸿雁, 张义平, 等. 蜂胶中黄酮成分及提取方法研究[J].云南大学学报, 2006, 28(增刊1)∶ 245-147.

[7]CHEN Chaorui, LEE Y N, CHANG C M J, et al. Hot-pressurized fluid extraction of flavonoids and phenolic acids from Brazilian propolis and their cytotoxic assay in vitro[J]. Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers, 2007, 38(3/4)∶ 191-196.

[8]刘元法, 王兴国, 金青哲. 超声波技术提取蜂胶黄酮类功能性物质的研究[J]. 食品科学, 2004, 25(6)∶ 35-39.

[9]牟兰, 王海燕, 曾唏. 贵州蜂胶成分分析(二)[J]. 中国养蜂, 2001, 52 (2)∶ 12-13.

[10]王影. 绿豆牙总黄铜的提取工艺研究[J]. 食品与发酵科技, 2010, 46 (5)∶ 45-48.

[11]吴东青, 徐新建, 张丽, 等. 响应面分析法优化竹节草黄酮提取工艺[J]. 食品科学, 2011, 32(8)∶ 125-128.

[12]刘洋, 赵谋明, 杨宁. 响应面分析法优化仙人掌多糖提取工艺的研究[J]. 食品与机械, 2006, 22(6)∶ 42-45.

[13]姚狄, 马平, 王颖, 等. 响应面法优化玉米芯中木聚糖的提取工艺[J].食品科学, 2011, 32(8)∶ 111-115.

[14]杨文雄, 高彦祥. 响应面法及其在食品工业中的应用[J]. 中国食品添加剂, 2005(2)∶ 68-71.

[15]李亚娜, 林永成, 余志刚. 响应面分析法优化羊栖菜多糖的提取工艺[J]. 华南理工大学学报∶ 自然科学版, 2004, 32(11)∶ 29-31.

Optimization of Microwave-Assisted Extraction of Flavonoids from Propolis by Response Surface Methodology

LI Shuai，ZHAO Yan-yan，CHEN Xiao-ping*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

This paper reports the optimization of process conditions for microwave-assisted extraction of flavonoids from propolis using response surface methodology. The effects of six operating parameters including microwave treatment time, microwave power, solvent composition (ethanol concentration), temperature, time and solvent-to-solid on total flavonoid yield were investigated through one-factor-at-a-time experiments. The significance and interaction effects of microwave treatment time, microwave power, ethanol concentration and temperature were analyzed by response surface analysis based on a threelevel central composite design. The optimal microwave-assisted extraction conditions for total flavonoids were determined as follows∶ 70 s microwave treatment at 282 W followed by extraction with 80% ethanol aqueous solution at a solvent-to-solid of 25 mL/g and 77 ℃ for 12 h. Under these conditions, the yield of total flavonoids from propolis was up to 25.08%.

propolis；flavonoids；extraction；response surface methodology

TS201.2

A

1002-6630(2012)18-0127-06

2011-07-16

李帅(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物化学与功能食品。E-mail：huajiyuji1986@163.com

*通信作者：陈晓平(1963—)，男，教授，博士，研究方向为食品生物化学与功能食品。E-mail：XP63@Tom.com